استاندارد

دانلود پایان نامه

۶ رقت ) محلول بدون قند بعنوان شاهد در نظر گرفته شد.
– به محلول فوق ۵ میلی لیتر محلول فنل ۵% که در اسید کلریدریک ا/۰ مولار حل شده است و به حجم رسیده است افزوده شد.
– به محلول فوق ۲۵ میلی لیتر اسید سولفوریک غلیظ، سریع و دقیق افزوده شد.
– هر نمونه سریعا ورتکس شده و در دمای اتاق خنک شد.
– جذب نمونه ها در طول موج ۴۹۰ نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد.
– منحنی بر اساس محور عمودی جذب نور و محور افقی غلظت رسم شد.

۳-۳-۱۰-۲ تهیه نمونه آزمونه
محلول صمغ با غلظت mg/L 1000 تهیه شد. بعلت ویسکوزیته بالای صمغ استخراج شده ابتدا محلول صمغ در آب ۶۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ ساعت و سپس در حمام آب اولتراسوند ۴۵ درجه به مدت ۱ ساعت قرار گرفت.
۵ میلی لیتر آب دیونیزه با ۴۰۰ میکرولیتر آب مقطر و۱۰۰ میکرولیتر از محلول صمغ mg/L 1000 مخلوط شد.
– به محلول فوق ۵ میلی لیتر محلول فنل ۵% (طبق فرمول قبل) افزوده شد.
– به محلول فوق ۲۵ میلی لیتر اسید سولفوریک غلیظ ، سریع و دقیق افزوده شد.
– نمونه در آزمون های متعدد سریعا در حمام آب ۹۰، ۹۳ (نقطه جوش) و ۹۶ درجه سانتی‌گراد(دمای جوش حاصل از مخلوط۱۰% آب مقطر و نمک طعام) قرار گرفت و پس از گذشت ۲ ساعت از عمل هضم، نمونه گیری هر ده دقیقه انجام شد.
– عدد جذب نمونه ها پس از خنک شدن نمونه با دستگاه اسپکتروفتومترخوانده و یادداشت گردید.
– پیک حداکثر جذب بدست آمد.
آزمون های فنل سولفوریک در دماهای ۹۰ درجه سانتی‌گراد، ۹۳ درجه سانتی‌گراد (نقطه جوش) و ۹۶ درجه سانتی‌گراد (نقطه جوش محلول ۶% نمک طعام وآب مقطر)، به مدت ۸ ساعت هیدرولیز شدند. پس از گذشت ۲ ساعت از هیدرولیز، هر ۱۰ دقیقه و یا ۵ دقیقه نمونه برداری انجام شد. نمونه ها برای تکمیل هیدرولیز به مدت ۳ تا ۴ روز(۷۲ تا ۹۶ ساعت) در شرایط آزمایشگاه رها شدند. پس از مشاهده تغییرات رنگ به صورت چشمی ، مقدار جذب محلول ها با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد.

۳-۳-۱۰-۳ استفاده از اتوکلاو:
روشی که برای صمغ مالوا بکار برده‌شد و جواب مناسب دریافت گردید استفاده از اتوکلاو ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد و ۱۵ PSI فشار(فشار بالا باعث افزایش دما و کاهش زمان آزمون می‌شود) بود. از نمونه اتوکلاو شده هر ۱۵ دقیقه نمونه برداری انجام شد و منحنی قند کل و استاندارد رسم گردید که مقادیر و نمودار استاندارد صمغ پنیرک، در نتیجه گیری آمده است.
حدود یک ساعت طول می کشید که دستگاه به دمای ۱۲۱ درجه برسد و پس از گذشت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد و فشار PSI 15 ، حدود ۳۰ دقیقه طول می کشید تا دما و فشار افت کند و درب اتوکلاو باز شود. پس از باز کردن درب دستگاه ، نمونه در دستگاه با درب باز ماند و سپس با گذشت یک ساعت در دمای آزمایشگاه با دستگاه اسپکتروفتومتر، جذب خوانده شد.

۳-۷ محلول فنل سولفوریک صمغ، قبل از اتوکلاو شدن ۳-۸ نمونه اتوکلاو شده با حداکثر عدد جذب

۳-۹ نمونه صمغ پس از جوشیدن(بلافاصله) ۳-۱۰ نمونه های صمغ پس از ۳ ساعت جوشیدن

۳-۱۱نمونه صمغ پس از ۴روز ماندن در دمای محیط

۳-۳-۱۱ آماده سازی محلول صمغ هیدرولیز شده:
نمونه صمغ هیدرولیز شده با محلول سود خنثی شد (۳۰/۷pH:) و به مدت ۱۵ دقیقه گاز زدایی گردید و از فیلتر ۲۲/۰ میکرومتر رد شد. نمونه صمغ هیدرولیز شده و خنثی شده طبق روش عمل شده برای استانداردهای قند مشتق‌سازی شد.
۳-۳-۱۲ آزمون کروماتوگرافی صفحه نازک
۳-۳-۱۲-۱ تهیه استانداردها و نمونه صمغ : تهیه نمونه و استانداردها به روش ۱۷ انجام شد.۱۰ میلی گرم از هر استاندارد (گلوکز، فروکتوز، گالاکتوز، آرابینوز، مانوز و رامنوز) در یک میلی لیتر حلال تشکیل شده از اتانل ۹۹% و آب به نسبت ۸ به ۲ حل شدند. ۲۰۰ میکرولیتر از نمونه صمغ هیدرولیز شده خنثی با ۸۰۰ میکرولیتر اتانل ۹۹% حل شد.
۳-۳-۱۲-۲ تهیه فاز حلال TLC: از روش ۶۶ برای تهیه فاز حلال استفاده شد.بوتانل، اتانل و آب به نسبت ۴۵، ۵ و ۴۶ با هم ترکیب شدند و۲۰۰ میلی لیتر از ترکیب حلال به تانک TLC ریخته شد.
۳-۳-۱۲-۳ آزمون کروماتوگرافی صفحه نازک: روی صفحات TLC از فاصله ۵/۱ سانتی متر از ابتدا نقطه گذاری با سرنگ انجام شد.نمونه ها شامل استانداردها و صمغ بود. صفحه در تانک TLC قرار گرفت و تا ۱۰ سانتی متر انتهای صفحه فاز حلال بالا رفت. صفحه از تانک خارج شده و در فضای آزمایشگاه خشک شد.
۳-۳-۱۲-۴ آشکارسازی لکه ها: از معرف آنیزیدین حل شده در اتانل به نسبت ۶۲/۰ گرم در ۱۰۰ میلی لیتر استفاده شد. صفحه با معرف مه پاشی شد و در دمای ۸۵ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه خشک شد.
۳-۳-۱۳ آزمون کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با دتکتور ماورای بنفش:
۳-۳-۱۳-۱ مشتق سازی به روش بنزیله کردن
در این روش از بنزیل کلراید برای مشتق سازی استفاده شد آزمون طبق روش میاگی و همکاران-۲۰۰۸ انجام شد. نمونه های محلول قند با ۲۰۰ میکرولیتر پتاسیم دی‌هیدروژن فسفات، ۳۰ میکرولیتر بنزیل کلراید و ۱۵۰ میکرولیتر سود ۸ نرمال مخلوط شدند و سریعا به مدت ۵ دقیقه ورتکس گردیدند. سپس ۱۰۰ مایکرولیتر اسیدفسفریک ۴/۱ مول بر لیتر و ۱۰۰۰ میکرولیتر اتیل استات افزوده شد و دوباره ۵ دقیقه ورتکس شد. از فاز رویین (اتیل استات) ۷۵۰ میکرولیتر برداشته شد وتبخیر گردید. باقی‌مانده در ۲۵۰ میکرولیتر استونیتریل-آب(۷۰:۳۰) حل شد.
محلول‌های بدست آمده با اسپکتروفتومتر در طول موج ماورای بنفش اسکن شدند. نتیجه عدم مشاده پیک مشتقات بود. البته چند مورد تزریق نمون
ه به دستگاه کروماتوگرافی مایع صورت گرفت که آن هم نتیجه‌ای نداشت.
۳-۳-۱۳-۲ آماده سازی محلول های استاندارد برای آزمون HPLC:
آماده سازی محلول های استاندارد منوساکاریدهای گلوکز، مانوز، فروکتوز، رامنوز، آرابینوز، گالاکتوز با روش شرح داده شده توسط۴۴ انجام شد.
در ابتدا از هر منوساکارید، محلول قندی استاندارد با رقت ۱۰۰۰ mg/L تهیه شد. (محلول مادر) قندها در آب دیونیزه دارای ۱۰ % متانول حل شدند. از محلول مادر رقت‌های مورد نظر تهیه گردید و دوباره هر استاندارد قند در مخلوط آب دارای ۱۰% متانول حل شدند. در آزمون‌های تکراری محلول مادر مستقیما مشتق‌سازی شد و محلول مشتق شده با آب دیونیزه به رقت‌های مورد نظر رقیق گردید.
پس از تهیه محلول مادر و محلولهای رقیق (استاندارد کاری) ، به مدت ۱۵ دقیقه در حمام اولتراسونیک گاز زدایی شدند و در دمای ۴ درجه سانتی گراد تا زمان استفاده نگه‌داری شدند.

مطلب مشابه :  تحقیق دربارهژئوپلیتیک، ژئواکونومی، پایان تاریخ، نظام جهانی

۳-۳-۱۳-۳ مشتق سازی محلول های استاندارد و صمغ با فنیل متیل پیرازولون:
مشتق سازی طبق روش ۴۴ انجام شد.
محلول های ۳/۰ مولار آبی سود و۳/۰مولار آبی اسید کلریدریک و محلول متانوله ۵/۰ مولار ۳۱PMP تهیه شدند.
نمونه های شاهد (بدون محلول قند) و ۶ محلول استاندارد و نمونه صمغ به ترتیب زیر مشتق‌سازی شدند.
به ۵۰۰ میکرولیتر از هر محلول ، ۵۰۰ میکرولیتر محلول آبی سود افزوده شد و سپس ۵۰۰ میکرولیتر محلول متانوله PMP به هر نمونه افزوده شد. نمونه ها به مدت ۹۰ دقیقه در بن ۷۰ درجه قرار گرفتند. هر ۱۵ دقیقه یک بار هم زدن نمونه‌ها انجام شد و یا از بن‌ماری شیکردار استفاده شد. نمونه ها در محیط آزمایشگاه خنک شدند و با ۵۰۰ میکرولیتر اسید‌کلریدریک ۳/۰ مولار خنثی شدند. نمونه های مشتق شده با PMP ، ۴ بار با ۱۰ میلی لیتر کلروفرم شستشو داده شدند. هر مرحله شستشو با کلروفرم ۱۵ دقیقه به طول انجامید. پس از هر مرحله محلول زیرین (کلروفرم) حذف شده و به محلول رویین دوباره ۱۰ میلی لیتر کلروفرم افزوده شد. پس از مرحله چهارم شستشو، محلول مشتق شده کاملا شفاف شد. محلول رویین با فیلتر ۴۵/۰ میکرومتر صاف گردید.

۳-۱۲مرحله صاف کردن مشتق با فیلتر سرسرنگی
۳-۳-۱۳-۴ آماده سازی فازهای حلال
آماده سازی فازهای متحرک برای آنالیز دستگاهی طبق روش ۴۴، با کمی اصلاحات انجام شد:
محلول A: استونیتریل در صافی ۲۲/۰ میکرومتر و پمپ خلاء صاف شد.
محلولB: برای تهیه محلول A، KH2PO4 045/0 %(مقدار ۴۵/۰ گرم فسفات دی هیدروژن پتاسیم) و ۰۵/۰% تری اتیل آمین ( ۶۹۴ مایکرولیتر تری اتیل آمین) در۱۰۰۰ میلی لیتر آب دیونیزه حل شد. pH محلول به حدود ۱۰ رسید و با HCl تا pH 7 خنثی شد. محلول خنثی شده ، به کمک پمپ خلاء و صافی ۲۲/۰ میکرومتر (صافی میلی‌پور نوع GVWP با منافذ ۲۲/۰ میکرومتر) صاف شده و ۲۰ دقیقه در حمام اولتراسونیک گاز زدایی گردید.
مشخصات دستگاه HPLC: KNAUER آلمان
دتکتور: ۲۶۰۰, wellchrom- UV Detector, K
طول موج دتکتور UV: 238 نانومتر
سرعت جریان: شستشو با سرعت جریان ۱ میلی لیتر در دقیقه انجام شد. (در دمای محیط آزمایشگاه)
ستون: C18 Bio300A- 4.6mm×۲۵۰ mm(5 µm)
پمپ: HPLC PUMP K- 1001
در ابتدای هر آزمون برای اطمینان از کار دستگاه و به تعادل رسیدن ستون با فاز متحرک، به مدت ۳۰ تا ۱ ساعت ستون با فازهای حلال شستشو داده شد. حجم تزریق ۲۰ مایکرولیتر بود.
۳-۳جدول گرادیان شستشو:
زمان شستشو(دقیقه)
درصد فاز متحرک A(استونیتریل)
درصد فاز متحرک B
۱۵-۰
۹۰
۱۰
۴۰- ۱۵
۸۶
۱۴
۴۵-۴۰
۹۰
۱۰

مطلب مشابه :  سطح معنی داری

۳-۳-۱۴ آزمون کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با آشکارساز ضریب شکست:
از دستگاه YL(YL instrument) با آشکار ساز ضریب شکست YL 9170 و ستون آمینه۱۰۰ NH2 Perfectsil MZ-Analytical(250×۴.۶mm) و پمپ: YL 9110 استفاده شد
دمای ستون و کانال آشکارساز ۳۵ درجه سانتی گراد
فاز حلال از استونیتریل- آب به نسبت های ۳۰-۷۰، ۵۰-۵۰، ۶۰-۴۰، ۷۵-۲۵و ۹۰-۱۰آزمون شد.
دمای دتکتور در ۳۰ و ۳۵ درجه آزمون شد.
سرعت جریان در ۱، ۷/۰، ۵/۰ و ۳/۰ آزمون گردید.
رقتهای مختلف منوساکاریدها از ۱ میلی گرم بر لیتر تا ۱۰۰۰۰ میلی گرم بر لیتر تزریق شد.
کلیه رقتها در محلول استونیتریل – آب(۷۵-۲۵) تهیه شدند.
آزمون به روش وان ویچن،۲۰۱۳ و گوئیج،۲۰۱۳ با کمی اصلاحات انجام گردید (۳۴و۶۰).

فصل چهارم
نتایج

۴-۱ آنالیز رطوبت گیاه پنیرک:
رطوبت نمونه خشک شده سبزی بر پایه استاندارد ملی ایران به شماره ۲۷۰۵انجام گردید و نتایج زیر بدست آمد(۱۰). نتایج در جدول ۴-۱ آمده است.
۴-۲ آنالیز خاکستر کل گیاه پنیرک:
خاکستر کل نمونه خشک شده سبزی بر پایه استاندارد ملی ایران به شماره ۲۷۰۶ انجام گردید و نتایج زیر بدست آمد(۱۱). نتایج در جدول ۴-۱ آمده است.
۴-۳ آنالیز چربی کل گیاه پنیرک:
چربی نمونه خشک شده سبزی بر پایه استاندارد ملی ایران به شماره ۲۸۶۲ انجام گردید و نتایج زیر بدست آمد(۸) . نتایج در جدول ۴-۱ آمده است.
۴-۴ آنالیز پروتئین گیاه پنیرک:
پروتئین نمونه خشک شده سبزی بر پایه استاندارد ملی ایران به شماره ۲۸۶۳ انجام گردید و نتایج زیر بدست آمد(۹) . نتایج در جدول ۴-۱ آمده است.
جدول۴-۱ مشخصات آنالیز پودر سبزی و صمغ محلول در آب استخراج شده از برگ و ساقه پنیرک:
ردیف
مشخصات آنالیز سبزی پنیرک
نتیجه آنالیز
(درصد وزنی)
۱
رطوبت
۱۷۴/۰±۰۰/۸
۲
خاکستر
۰۹۳/۰±۵۰/۱۵
۳
چربی
۱۶۵/۰±۳۷/۱
۴
پروتئین
۰۸/۰±۴۶/۲۵

ترکیب اسیدهای چرب

۵
اسید کاپریک(C10)
۴/۰±۶/۱
۶
اسید لوریک (C12)
۲۲/۰±۰/۱
۷
اسید دودکانوئیک(C12:1)
۰۷/۰±۶/۰
۸
اسید میریستیک (C14)
۵/۰±۶
۹
اسید میریستولئیک(C14:1c)
۳۱/۰±۵/۰
۱۰
اسید پالمیتیک(C16)
۸/۱±۶/۱۲
۱۱
اسید پالمیتولئیک(C16:1c)
۴۳/۰±۳/۱
۱۲
اسید استئاریک(C18)
۲۵/۰±۹/۱
۱۳
اسید اولئیک (C18:1c)
۲/۱±۰/۱۳
۱۴
اسید لینولئیک(C18:2c)
۰/۱±۳/۱۵
۱۵
اسید آراشیدیک(C20)
۰۵/۰±۵/۰
۱۶
اسید لینولنیک(C18:3c)
۵/۴±۹/۴۱
۱۷
اسید بهنیک (C22)
۷/۰±۶/۳

استرول

۱۸
براسیکا استرول
۰۲/۰±۶۴/۰
۱۹
کمپسترول
۱۲/۰±۱۷/۸
۲۰
استیگما استرول
۱/۲±۶۵/۲۳
۲۱
بتا سیتوسترول
۸/۲±۵/۶۷

۴-۵ نتایج آنالیز ترکیب اسیدهای چرب گیاه پنیرک:
ترکیب اسیدهای چرب نمونه خشک شده سبزی بر پایه استانداردهای ملی ایران به شماره ۴۰۹۰ و ۴۰۹۱ انجام گردید و نتایج زیر بدست آمد(۱۵ و۱۶).

نمودار۴-۱ گاز کروماتوگرافی اسیدهای چرب برگ و ساقه پنیرک
جدول ۴-۲ نتایج گازکروماتوگرافی اسیدهای چرب پنیرک

۴-۶ نتایج آنالیز استرول گیاه پنیرک:
استرول نمونه خشک شده سبزی بر پایه استاندارد ملی ایران به شماره ۱۶۳۲۴ انجام گردید و نتایج زیر بدست آمد (۱۷).

نمودار۴-۲ استرول‌های برگ و ساقه پنیرک(دقیقه ۱۵ :براسیکا استرول، دقیقه ۱۶: کمپسترول، دقیقه ۱۷: استیگما استرول، دقیقه ۵/۱۹: بتا سیتوسترول)

جدول ۴-۳ نتایج گازکروماتوگرافی استرول‌های پنیرک
Index
RT[min]
Area[mV*s]
Width[sec]
Area%
۱
۱۴.۹۸۷۵
۱.۰۵۱۹
۱۸.۲۵۰۰
۰.۶۴۶۵
۲
۱۵.۸۸۹۲
۱۳.۳۰۳۴
۳۳.۵۰۰۰
۸.۱۷۶۸
۳
۱۷.۰۵۶۷
۳۸.۴۹۳۵
۳۷.۷۰۰۰
۲۳.۶۵۹۷
۴
۱۹.۳۶۳۳
۱۰۹.۸۴۷۷
۸۱.۵۵۰۰
۶۷.۵۱۷۰

همان طور که از نتایج بر می آید بتاسیتوسترول ۵/۶۷% استرول‌های پنیرک را تشکیل می‌دهد و کمترین درصد از آن براسیکااسترول می‌باشد. بتا سیتوسترول شاخص استرول های گیاهی است و نشان می دهد که استرولهای استخراجی از یک گیاه استخراج شده اند. مقادیر کمپسترول و استیگما استرول به ترتیب عبارتند از ۱۲/۰±۱۷/۸، ۱/۲±۶۵/۲۳ می باشند.

۴-۷ نتایج آنالیز ترکیب مواد معدنی گیاه پنیرک:
نتایج آزمون مواد‌ معدنی در جدول ۴-۴ آمده است.

جدول ۴-۴. ترکیب املاح سبزی پنیرک
ردیف
ترکیب فلزات
نتیجه آنالیز

۱
فسفر(میلی‌گرم بر گرم)
۲۹/۰±۸۹/۳
۲
کلسیم(میلی‌گرم بر گرم)
۹۱۲/۰±۶۱/۲۸
۳
مس(میکروگرم بر گرم)
۹۱۹/۰±۵۷/۱۱
۴
آهن(میکروگرم بر