اتانل

دانلود پایان نامه

ا اتانل در نسبت‌های (W/W) 10:1 در یک حمام آب جوش برای ۲ ساعت گذاشتند تا چربی‌زدایی و حذف رنگدانه‌ها و ساپونین‌ها رخ دهد. رسوب اتانلی را صاف کردند و مابقی دور انداخته شد.
ماده جامد باقی‌مانده را در هوای آزاد تا وزن ثابت خشک کردند. ماده خشک شده با استون به نسبت ۱:۱۰ در یک حمام جوش برای ۲ ساعت تیمار شد تا چربی و رنگدانه بهتر حذف شود. پس از صاف کردن، مواد بدون چربی را در هوا خشک کردند. مواد بدون چربی برای ۳ بار با آب گرم (OC50) به نسبت ۱:۶ (W/W)هر بار پس از ۲ ساعت، استخراج شدند. محلول را صاف و سانتریفوژ کردند (G5000) تا مواد نامحلول در آب حذف شوند. محلول رویی را با معرف سواگ (۱- بوتانل/کلروفرم با نسبت V/V 1:4) 10 بار پروتئین‌زدایی کردند. پس از حذف معرف سواگ، محلول رویی (فاز آبی) با H2O2 30% در دمای اتاق تا ۲ ساعت تیمار شد تا محول صمغ بی‌رنگ شود. محلول حاصل را تا حجم یک‌سوم در روتاری تحت خلاء ۴۰ درجه تغلیظ کردند و بعد pH محلول تغلیظ شده با HCl2مولار تنظیم شد. هیدروکلوئیدهای محلول آبی با اتانل(نسبت حجمی۱:۳) رسوب کردند. سپس جمع‌آوری و صاف شده و سپس با دقت با اتانل خالص، استون و اتر شستشو دادند تا گروه‌های لیپیدی قند‌های آزاد و ساپونین‌ها جدا شوند. صمغ خام را جمع آوری و در هوا خشک کردند.
جهان بین و همکارانش خالص سازی صمغ چوبک را با روش امین و همکاران(۲۰۰۷) و با کمی اصلاحات انجام دادند. صمغ خام را با کمپلکس باریوم خالص نموده و محلول صمغ ۳% را با هم‌زدن دائم برای ۱۰ ساعت در ۶۵ درجه سانتی‌گراد آماده کردند و با محلول هیدروکسید‌باریوم اشباع رسوب‌گیری نمودند. کمپلکس را با سانتریفوژ rpm 4000 به مدت ۱۵ دقیقه جدانمودند. رسوب جمع‌آوری شد و در اسید‌استیک ۱ مولار قرار گرفت و برای ۷ ساعت هم زدند و بعد سانتریفوژ نمودند. مایع رویی با اتانل۹۰% رسوب‌گیری شد و رسوب را با اتانل ۸۰، ۹۰ و ۹۵% شستند و نهایتا با آب شیر برای ۴۸ ساعت دیالیز نمودند و برای۴۸ ساعت دیگر در آب دیونیزه دیالیز ادامه داشت.
پس از دیالیز، محلول صمغ را از صافی ۴۵/۰ میکرون غشاء میلی‌پور گذراندند و در فریز‌درای به مدت ۲ تا ۴ ساعت تحت خلاء و یا در هوای آزاد به مدت ۳۰ تا ۳۶ ساعت خشک کردند. صمغ فریز‌درای شده را برای آنالیز HPLC و آنالیزهای فیزیکی بکار بردند و صمغ خشک شده در هوای آزاد را برای تحقیقات شیمیایی بکار بردند (۳۸).
در تحقیق “کوئمینر و همکاران” در سال ۲۰۰۰ محلول‌سازی و رسوب‌گیری اتانلیک پودر‌های هیدروکلوئید مرجع این چنین بوده‌است:
روش‌های محلول‌سازی روی پودرهای کاراگینان مرجع در آب بسیار خالص در ۹۰ تا ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد برروی غلظت ۱ گرم در۱۰۰ میلی‌لیتر هیدروکلوئید انجام شد. به ‌دنبال آن رسوب‌گیری از محلول آبی هیدروکلوئید با اتانل۸۰%(V/V) در دمای ۴ درجه ‌سانتی‌گراد در دوره‌های زمانی ۱، ۱۶ و ۷۲ ساعت انجام شد.
رسوب بدست آمده با کروسیبل G4 تحت خلاء برای ۱۶ ساعت در ۴۰ درجه ‌سانتی‌گراد خشک شدند.
اجزای خشک شده وزن شدند و برای تیمار متانولیزیس بکار رفتند
در تحقیق” لین و همکاران” در سال ۲۰۱۲ بر روی پلی‌ساکاریدهای محلول در آب گیاه حرا، آماده‌سازی پلی‌ساکارید‌های خام را بدین ترتیب انجام دادند: ۳۰۰گرم پودر خشک شده ساقه و برگ را با ۳ لیتر اتانل ۹۵% برای ۳ ساعت در مبرد معکوس حرارت دادند تا اجزای محلول‌دراتانل حذف شوند. سپس مخلوط با سانتریفوژ ۲۰۰۰G برای ۱۰ دقیقه جدا شد. باقی‌مانده ۲ بار دیگر به روش فوق استخراج شد و در ۵۰ درجه سانتی‌گراد برای ۱۰ ساعت خشک شد.
زای و همکاران در سال ۲۰۱۰، تهیه پلی‌ساکارید‌های برگ‌های چای را ‌چنین شرح داده‌اند که ۲۵۰ گرم از برگ‌های خشک و آسیاب شده را با ۲ لیتر آب‌مقطر در دمای ۹۰ درجه سانتی‌گراد درحمام آب به مدت ۲ ساعت استخراج کردند. پس از صاف کردن، باقی‌مانده را دوباره با ۵/۲ لیتر آب‌مقطر برای ۲ ساعت دیگر استخراج نمودند. سپس عصاره‌ها سانتریفوژ شدند تا آلایش آنها جدا شود. محلول رویین با تبخیر در روتاری تغلیظ شد و با اتانل ۹۵% رسوب‌گیری شد. رسوب را در آب حل کرده و روی آن دیالیز انجام دادند تا مولکول‌های کوچک حذف شوند. محلول دیالیزشده را به روش انجمادی خشک نمودند (۶۴).
در تایلند در سال ۲۰۱۱ “اسریچامروئن و همکارش” صمغ مغز دانه پنیرک را به روش قلیایی استخراج کردند که در مقایسه با عصاره استخراج آبی، خواص ژل کننده بالایی داشت. به این ترتیب که : دانه مالوا را تا دانه‌بندی ۵/۰میلی‌متر آسیاب کردند و به نسبت ۱ به ۱۰۰ حجمی-حجمی در آب مقطر پخش نمودند. در حمام آب جوش ۵/۱ ساعت ماند و محلول در دمای اتاق خنک شد و به آن NaOH در غلظتهای ۰۵/۰، ۱/۰ و ۲/۰ مولار اضافه شد و به نسبت ۱ به ۱ با اتانل خالص تیمار شد. رسوب را حذف کردند و صمغ به pH 4/7 رسید و در دمای (۲۰-) درجه سانتی‌گراد تا زمان آزمون نگهداری نمودند. صمغ استخراج شده با آب را با نام”صمغ معمولی” با همین روش و بدون استفاده از NaOH بدست آوردند غلظت ۱% وزنی-وزنی صمغ از غلظت ۵/۰% موثر‌تر بود و مخلوطی از صمغ مغز دانه گوار، تجزیه گلوکز از نشاسته را در فرایند دیالیز آزمایشگاهی تا ۵۰-۸۲% در مقایسه با شاهد کاهش داد و مخلوط مغز دانه مالوا و گوار کاهش بالاتری (۳ تا ۷ برابر) را در تجزیه ۱۵ الی ۳۰ دقیقه‌ای نشان دادند (۵۶).
درتحقیق سال ۲۰۱۱ “زاهدی و همکاران “برگهای گیاه مالوا را جدا کرده و در ۶۰ درجه سانتی‌گراد خشک نمودند. برگهای خشک شده را آسیاب کردند و در آب‌مقطر به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گ
راد قرار دادند(برای بدست آوردن غلظتهای ۵/۲، ۵، ۵/۷ و ۱۰ گرم از برگ خشک در ۱۰۰ میلی لیتر آب‌مقطر) آب‌مقطر را بعنوان شاهد در نظر گرفتند. بعد از خیساندن محلول را، در تنظیف ۴ لایه‌ای صاف کردند و صاف شده ۴ ساعت سانتری‌فوژ شد(دور سانتری‌فوژ گزارش نشده است). سوپرناتانت را دوباره با استفاده از فیلتر ۲/۰ میلی‌متری صاف کردند (۶۴).
در مقاله “کانگ و زیا “در سال۲۰۱۳، استخراج پلی‌ساکارید E.sinica به روش زیر انجام شده است:
ریشه های خشک E.sinica را پودر کردند. یک کیلوگرم پودر خشک را با ۱۰ حجم اتانل ۹۵% زیر مبرد معکوس، هر بار به منظور حذف لیپیدها به مدت ۳ ساعت مخلوط کردند.
پس از ۳ بار استخراج، باقی‌مانده را در هوای آزاد خشک کرده و سپس با ۱۰ حجم آب‌مقطر هر بار، برای ۲۴ ساعت در ۴ درجه سانتی‌گراد استخراج نمودند. استخراج‌های آبی را صاف کرده و تا۱۰ بار تغلیظ نمودند وبا اتانل ۹۵% تا ۸۰% غلظت نهایی افزودند.
رسوب را در ml600 آب حل نموده و ۱۵ بار با ml 200 محلول ۵:۱ از کلروفرم :n- بوتانل طبق روش ساتوب، پروتئین زدایی کردند.
جدا شده آبی حاصل را با آب معمولی برای ۴۸ ساعت و با آب مقطر برای ۴۸ ساعت کاملا دیالیز کردند (کات آف جرم مولکولی ۳۵۰۰ دالتون) و رسوب را با اتانل بدون آب شستند و سپس در آب حل کرده و لیوفیلیزه نمودند تا پلی‌ساکاریدهای محلول در آب سرد (مقدار ۵/۸ گرم) با سانتریفوژ جمع شوند(دمای ۲۰ درجه سانتی‌گراد زمان ۱۰ دقیقه و سرعت rpm3000).

مطلب مشابه :  پایان نامه با واژگان کلیدیرضایت از زندگی، همبستگی پیرسون

۲-۴ هیدرولیز پلی‌ساکاریدها:
در مقاله “سیلوا و همکاران” هیدرولیز پلی‌ساکاریدهای دیواره سلولی پوست پرتقال را به روش زیر انجام دادند:
منوساکاریدها را از پلی‌ساکاریدهای دیواره سلولی با یک مرحله هیدرولیز اولیه طبق روش Selvendran و همکاران آزاد کردند.
۲ میلی‌گرم از جزء نامحلول در الکل و ۲۰۰ میکرولیتر از H2SO4(molL-1 11) را در یک لوله واکنش‌گر پس از رقیق‌سازی برای مدت ۳ ساعت در molL-11 اسیدهیدرولیز کردند و هیدرولیز برای مدت ۵/۲ ساعت در ۱۰۰ درجه‌سانتی‌گراد، دمای اتاق صورت گرفت. سپس برای قطع واکنش در دمای اتاقمحلول را خنک کردند و ترکیب هیدرولیز شده را تبخیر نمودند تا خشک شود (۵۴).
“لو و همکاران” پلی‌ساکاریدهای چای را به روش زیر هیدرولیز کردند:
۲۰ میلی‌گرم پلی‌ساکارید را در ۲ میلی‌لیتر تری‌فلوئورو‌استیک اسید ۳ مولار حل کردند و آمپول در اتمسفر نیتروژن بسته شد و در حمام آب‌جوش نگهداری شد تا پلی‌ساکاریدها طی ۸ ساعت به اجزای منوساکاریدی تجزیه شوند.
نمونه را در دمای اتاق خنک کرده و ۵ دقیقه با دور rpm 1000 سانتریفوژ کردند. محلول رویی را جمع‌آوری وتحت خلاء خشک کردند. به محلول نمونه خشک و هیدرولیز شده‌، ۱ میلی‌لیتر آب مقطر افزودند تا برای آزمون آماده شود (۴۴).
روش آنالیز قندهای صمغ چوبک در مقاله “جهان‌بین و همکاران “در سال ۲۰۱۲ به شرح زیر بوده است:
قند کل با روش فنل‌سولفوریک‌اسید اندازه‌گیری شد و با استفاده از D-گلوکز بعنوان استاندارد در ۴۹۰ نانومتر و اسیدهای اورونیک با روش m- هیدروکسی‌دی‌فنیل با استفاده از اسیدگالاکتورونیک بعنوان استاندارد اندازه‌گیری شدند.
همچنین در تحقیق “جهان بین و همکاران” هیدرولیز صمغ برای اندازه‌گیری ترکیب قند به شرح زیر انجام شد:
آنها محتوای قند را طبق روش بنهورا(۲۰۰۲) با اصلاح اندک اندازه‌گیری کردند. نمونه ۱۰ گرمی صمغ خشک شده انجمادی را در ۱۲۰ درجه ‌سانتی‌گراد برای۳ ساعت با ۱ میلی‌لیتر اسید تری‌فلوئورواستیک در یک لوله در‌بسته حرارت دادند. اسید اضافی با تبخیر سریع بر روی حمام آب در یک دمای ۴۰ درجه سانتی‌گراد حذف شد و با آب (۳ برابر) تقطیر شد. محلول هیدرولیز شده را با ۵۰ میلی‌گرم NaBH4 احیا کرده و با صافی فیلتری ۴۵/۰ میکرونی صاف نمودند و ۰۲/۰ میلی لیتر از نمونه را به ستون HPLC تزریق کردند (۳۸).
در مقاله “دوبیوس و همکاران” در سال ۱۹۵۶با عنوان رنگ‌سنجی برای اندازه‌گیری قندها و ترکیبات وابسته آمده است:
قندهای ساده ، الیگوساکاریدها، پلی‌ساکاریدها و مشتقات آنها شامل متیل‌اترها، قندهای احیاکننده و بالقوه با پیوندهای احیا‌کننده در تیمار با فنل و اسیدسولفوریک غلیظ رنگ زرد پرتقالی می‌دهند. درنتیجه واکنش فنل- سولفوریک‌اسید یک روش توسعه یافته برای اندازه‌گیری مقادیر بسیار اندک قندها و اجزای وابسته به آنها است. با پیوند با کروماتوگرافی کاغذی روش برای اندازه‌گیری ترکیب پلی‌ساکاریدها و مشتقات آنها مناسب است (۲۹).
آزمون‌های رنگ‌سنجی برای قندهای احیا‌کننده و پلی‌ساکاریدها از زمان‌های قدیم شناخته شده است. معرف‌هایی همچون۱-نفتول برای کلیه کربوهیدرات‌ها، بنزیدین برای پنتوزها و اسیدهای اورونیک، نفتورزورسینول برای اسیدهای اورونیک و رزورسینول، نفتورزورسینول و دی‌سولفونیک‌رزورسینول‌اسید برای کتوز‌ها مثال‌های شناخته شده‌ای از آزمون‌های رنگ‌سنجی هستند که ممکن است در محلول اسیدی انجام شوند. در این‌گونه آزمون‌ها و اصلاحات آنها، آمین‌ها و فنل‌های آروماتیک بکار می‌روند. پلی‌ا‌ُل‌ها و کربوهیدرات‌های دارای گروه‌های احیا‌کننده ممکن است با معرف نقره تولنز۱۶ ، جستجو شوند؛که شاید یکی از بهترین‌ معرف‌‌ها در هنر کروماتوگرافی باشد. همچنین قند‌های احیاکننده با اسیدپیکریک۱۷، O-دی‌نیتروبنزن و متیلن‌بلو جستجو می‌شوند در‌حالیکه دی‌آزوراسیل مخصوص ساکارز و الیگوساکاریدها و پلی‌ساکاریدهای دارای اجزای ساکارز می باشند.
روش‌ه
ای حجم‌سنجی مثل کاربرد پتاسیم‌ فری‌ سیانید، سولفات ‌سریک۱۸ و سولفات ‌مس و سدیم‌ هیپویدات برای اندازه‌گیری مقادیر اندک قندهای احیاکننده پس از جداسازی با کروماتوگرافی کاغذی کاربرد دارند.
گرچه تجربه نشان داده‌است که این روش‌ها نیازمند مهارت قابل‌توجه هستند و زمان‌‌بر می‌باشند و در برابر تنوع مقادیر اندک قند، حساس هستند.
معرف‌های آنترون و ۱-نفتوسولفونات برای محلول‌های قندی استاندارد عالی هستند اما وقتی در آنالیز‌های قند‌های جدا شده با کروماتوگرافی کاغذی عمل می کنند حضور مقدار اندکی از ترکیبات توسعه‌دهنده حلال ممکن است آنها را غیرقابل استفاده کند.
بیشتر قندها با یک صافی کاغذی و با یک حلال فنل-آب قابل جداسازی هستند اما بعد با معرف آنترون قابل اندازه‌گیری نیستند زیرا فنل باقی‌مانده در کاغذ به‌شدت در رنگ سبز تولید شده با معرف آنترون مداخله می‌کند. بعلاوه معرف آنترون گران است و محلول‌های آن در اسید‌سولفوریک پایدار نیستند. روش آنترون با اینکه برای قندهای آزاد و گلیکوزیدهای آنها رضایتبخش است برای قندهای متیله شده و پنتوزها کاربرد محدودی دارد. گرچه حلال بوتانل-اسیدپروپیویک-آب یک حلال عالی برای جداسازی دی‌ساکاریدها است؛ اسیدپروپیونیک باقی‌مانده با روش ۱-نفتوسولفونات مداخله‌گر است. آنیلین‌فتالات و آنیلین‌تری‌کلرواستات برای اندازه‌گیری رنگ‌سنجی قندها و مشتقات آنها سازماندهی شده‌اند. این معرف‌ها برای کتوز‌ها نامطلوب هستند.
فنل در حضور اسید‌سولفوریک برای اندازه‌گیری رنگ‌سنجی اندازه‌های میکرونی قندها و مشتقات متیله آنها، الیگوساکاریدها و پلی‌ساکاریدها بکار می‌روند. این روش خصوصا برای اندازه‌گیری مقادیر کوچک قندهای جداشده با کروماتوگرافی کاغذی با حلال فنل-آب و نیز برای قندهایی که فرار هستند مثل بوتانل-اتانل-آب، اتیل‌استات-اسیداستیک-آب یا متیل‌اتیل‌کتون-آب مناسب هستند. روش، ساده، سریع و حساس است و نتایج تکرارپذیر می‌دهد. معرف ارزان و پایدار است و محلول حاصل فقط یک منحنی استاندارد برای هر قند لازم دارد. رنگ تولید شده پایدار است و نیازمند توجه خاصی برای کنترل شرایط آزمون نمی باشد.
جذب رنگ زرد پرتقالی برای هگزوز‌ها در ۴۹۰ نانومتر و برای پنتوز‌ها و اسیدهای اورونیک در ۴۸۰ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود (۲۹).
همچنین، برای بدست آوردن منوساکاریدهای ترکیبات حاصل از پلی‌ساکاریدهای مالوا نگلکتا ایلجین در سال ۱۹۸۹ “لیگای و همکاران” ترکیبات استخراج شده را با اسیدسولفوریک ۲ نرمال در ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد و به مدت ۴۸ ساعت هیدرولیز کردند