اندازه گیری و نگهداری

دانلود پایان نامه

5mg
BA
8g
آگار
بعد از اضافه نمودن نمک ها، ویتامین، هورمون ها، آهن و مایو اینوزیتول ، کازئین، PVP و ساکارز به محلول محیط کشت آن را به حجم مورد نظر یعنی Lit 1رسانیده و به وسیله هیدروکسید سدیم (NaoH) و اسید کلریدریک (Hcl) 0/1 نرمال PH محیط کشت بر روی 8/5 تا 9/5 تنظیم گردید. در مرحله آخر 8 گرم آگار را به محیط کشت افزوده و پس از بستن درب ظرف با استفاده از اتوکلاو استریل گردید. شیشه های مورد نیاز جهت توزیع محیط کشت را نیز اتوکلاو نموده تا استریل شوند. (دمای 121 درجه فشار 121 کیلو پاسکال به مدت 20 دقیقه) .سپس هود لامینار را با الکل کاملا استریل نموده و به مدت 20دقیقه لامپ یووی آن را روشن نموده تا فضای زیرهود کاملا استریل شود.بعد از اتمام کار اتوکلاو محیط کشت و شیشه ها را به زیر هود منتقل نموده وبعد از خنک شدن ظرف حاوی محیط کشت به گونه ای که دست را نسوزاند در شیشه ها توزیع نموده( تقریبا20 تا30 سی سی)و به مدت 1 هفته قبل از کشت آنها را در اتاقک کشت نگهداری نموده تا از عدم آلودگی آنها مطمئن شویم. شیشه های کشت که جهت افزایش کالوس ها مورد استفاده قرار گرفتندرا درون اتاقک کشت با دمای درجه سانتی گراد نگهداری نمودیم. به منظور جلوگیری از تولید کلروفیل چند برابر شدن کالوس ها شیشه های حاوی کالوس را درون جعبه هایی قرار داده و هر 30 روز آنها را واکشت نموده تا حجم کالوس های روشن اولیه به میزان بالاتری افزایش یابد بعد از 6 ماه به دست آمدن حجم دلخواه از کالوس های مرزه خوزستانی تیمارهای نوری مورد بحث مورد آزمایش قرارگرفتند.
3-3-3- کشت کالوس ها در تیمارهای نوری مختلف
به منظور بررسی تیمارهای نوری مختلف برویژگی های رشد و ترکیبات فنلی در کالوس مرزه خوزستانی تعداد 63 شیشه محیط کشت را آماده نمودیم و واکشت کالوس های مرزه را با وزن تر اولیه 2 گرم درشیشه ها آغاز نمودیم. سپس برای هر تیمار 3 واحد آزمایشی که همان شیشه ها هستند و 3 تکرار را در نظر گرفتیم و هرکدام از آن ها را به صورت جداگانه به عنوان شاهد، تیمار تاریکی، تیمار نوارفرابنفش A (که به 2 حالت 4 ساعته و 2 ساعته مورد بررسی مجزا قرار گرفت ) تیمار نوار فرابنفش B (که به 3 حالت مجزا به صورت 2 دقیقه ، 5 دقیقه و 10 دقیقه بررسی شدند ). پس از 4 هفته تمامی تیمارهای نوری را برداشته و ویژگی های رشدی از جمله وزن تر آنها را اندازه گیری نموده و سپس با قرار دادن آنها به مدت 2 ساعت در فریزر 80 – و سپس انتقال به فریزدرایر کالوس ها را خشک نموده و وزن خشک آنها را نیز اندازه گیری نمودیم..
3-3-4- شدت نوری در اتاقک کشت وانواع لامپ های فرابنفش استفاده شده
شیشه هایی که به عنوان شاهد در یکی از شلف های اتاقک کشت قرار داده شده تحت تاثیر 3 لامپ فلوئورسنت 24W قرار گرفتند که فتوپریود آنها 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی تنظیم شده بود برای اندازه گیری شدت نوری در شلف مورد نظر از دستگاه لوکس متر استفاده نموده بدین صورت که لوکس متر را در پنج نقطه متفاوت قرار داد و میانگین اعداد به دست آمده که معادل 8/1794 لوکس بود شدت نور مورد استفاده را نشان می داد. شیشه هایی که به عنوان تیمار نور فرابنفش A مورد بررسی قرار گفتند به 2 گروه 2 ساعته و 4 ساعته تقسیم بندی شدند. بدین منظور از 2 تایمر که یکی روی 2 ساعت و دیگری 4 ساعت گردیده بود استفاده شد. این شیشه ها به مدت 4 هفته در معرض نور ترکیبی فلوئورسنت و فرابنفش A قرار گفتند که 3 لامپ فلوئورسنت 24w با فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و 3 لامپ فرابنفش (4w)A که به صورت جداگانه برای هر کدام از تیمارها 2 ساعت و دیگری 4 ساعت در روز روشن می شدند مورد استفاده قرار گرفتند. شدت نوری که از 5 نقطه متفاوت از محل قرار دادن شیشه ها به دست آمد به صورت میانگین در مورد تیمار تابش فرابنفش A 2 ساعت 4/0 175 لوکس محاسبه شد.
شدت نور به صورت میانگین در رابطه با تیمار 4 ساعت تابش فرابنفش A 4/1886لوکس محاسبه شد.
شیشه هایی که به عنوان تیمار نور فرابنفش B مورد بررسی قرارگرفتند به 3 گروه تقسیم بندی شدند. شیشه های حاوی کالوس پس از واکشت به مدت 2 هفته در معرض مستقیم نور 3 لامپ فلوئورسنت قرار گرفتند سپس در روز چهاردهم، 9 شیشه را در زیر هودلامینار که از قبل با الکل و اشعه فرابنفش به مدت 20 دقیقه استریل شده بود قرار داده و درب شیشه ها را باز نموده و به مدت 2 دقیقه یووی هود که از نوع فرابنفش B می باشد را روشن نموده بعد از اتمام 2 دقیقه درب شیشه هارا بسته و سری دوم از شیشه ها یعنی 9 شیشه دیگر را برداشتیم و زیر هود در معرض 5 دقیقه یووی B قرار دادیم . بعد از این مرحله 9 شیشه دیگر را به مدت 10 دقیقه در معرض یووی B هود لامینار قرارگرفت . بعداز اتمام این مرحله تمامی شیشه ها مجدد به مدت دو هفته در معرض مستقیم نور فلوئورسنت قرارگرفتند شدت نور محاسبه شده در 5 نقطه متفاوت از محل قرار گیری شیشه ها 6/1886 لوکس به دست آمد.
شیشه های که به عنوان تیمار تاریکی مورد بررسی قرار گرفتند پس از واکشت به مدت 4 هفته در درون جعبه در اتاقک رشد به دور از نور مستقیم قرار گرفتند.
3-3-5- اندازه گیری ویژگی های رشدی کالوس های مرزه خوزستانی در تیمارهای نوری مختلف
پس از 4 هفته از اعمال تیمارهای مختلف روی کالوس های مرزه خوزستانی تمامی شیشه ها را برداشته و پس از اندازه گیری وزن تر آنها را به صورت 2 ساعت در فریزر 80 – نگهداری نموده سپس به دستگاه فریزدرایر به مدت 2 روز جهت خشک شدن کالوس ها منتقل نمودیم. سپس وزن خشک تمامی کالوس ها اندازه گیری شد.
پس از محاسبه وزن تر و، وزن خشک – کالوس ها، میزان نسبی آب در کالوس ها وسرعت رشد نسبی کالوس ها مورد بررسی قرار گرفت.
3-3-6- سنجش اول : اندازه گیری میزان رزمارینیک اسید در تیمارهای نوری مورد بررسی
3-3-6-1- روش های مورد استفاده
3-3-6-2- اعمال تیمارهای نوری
پس از چند مرحله انجام واکشت کالوس های سفید رنگ مرزه خوزستانی و قرار دادن 2 گرم از کالوسهای مرزه خوزستانی در شیشه های حاوی محیط کشت مقدار 63 شیشه حاوی کالوس را تهیه نموده و به صورت 7 تیمار شامل 3 تکرار آنها را در نظر گرفته ایم. 9 شیشه از کالوس ها را در تاریکی قرار داده – 9 شیشه دیگر را در حالت شاهد و در نورفلوئورسنت گذاشته 9 شیشه را در تأثیر مستقیم نور فلوئورسنت (16 ساعت روشنایی، 8 ساعت تاریکی) و فرابنفش A ( 2 ساعت روشنایی) گذاشته ، 9 شیشه دیگر را در معرض مستقیم نور فلوئورسنت ( 16 ساعت روشنایی 8 ساعت تاریکی ) و فرابنفش A ( 4 ساعت روشنایی ) قرار داده ایم.
27 شیشه را پس از 2 هفته حضور در نور فلوئورسنت به صورت سه دسته 9 تایی تقسیم نموده و هر کدام را جداگانه در معرض نور فرابنفش B هود لامینار گذاشته ( گروه اول تابش 2 دقیقه فرابنفش B ، گروه دوم تابش 5 دقیقه فرابنفش B گروه سوم تابش 10 دقیقه فرابنفش B ).
3-3-6-3- اندازه گیری وزن تر و خشک
پس از 4 هفته از اعمال تیمار های نوری مختلف شیشه ها را برداشته و پس از اندازه گیری وزن تر با ترازو آن ها را به فریزدرایر منتقل نموده تا جهت اندازه گیری وزن خشک ، خشک شوند . پس از اندازه گیری وزن خشک با ترازوی دقیق میزان محتوای نسبی آب کالوس و سرعت رشد نسبی گزارش شد.
3-3-6-4-استخراج و عصاره گیری
در این مرحله برای هر تیمار 3 تکرار که شامل 3 واحد آزمایشی ( شیشه ) است در نظر گرفته شده است. جهت اندازه گیری دقیق تر ترکیبات فنلی 3 واحد آزمایشی در هر تکرار را با هم ترکیب نموده و میزان 5/0 گرم کالوس خشک شده مرزه را درون فالکون های 50 cc ریخته. جهت غوطه ور شدن کالوس ها در حلال متانول میزان 15cc متانول 80 درصد به هر فالکون اضافه نموده.سپس فالکون های حاوی کالوس را به صورت 10 تایی در حمام التراسونیک با دمای اتاق و به مدت ده دقیقه قرار دادیم. پس از اتمام مرحله سونیکشین جهت عصاره گیری پس از صاف کردن به وسیله کاغذ صافی با روش تبخیر در خلا کالوس ها خشک گردیدند و تک تک عصاره ها را به صورت جدا به دست آورده و درون فالکون ریخته سپس جهت جداسازی عصاره از ناخالصی ها در سانتریفیوژ با دور 4000 rpm و به مدت دو دقیقه قرار گرفتند . عصاره تازمان انجام آزمایش در یخچال قرار گرفت تا جهت اچ پی تی ال سی مورد استفاده قرار بگیرد.
3-3-6-5- اندازه گیری رزمارینیک اسید
ردیابی رزمارینیک اسید با استفاده ازسیستم کروماتوگرافی لایه نازک با کارایی بالا جداسازی وشناسایی رزمارینیک اسیدباهمین سیستم و به روش پیشنهادی(Reich&Schibli 2006) به روش زیر انجام شد.