تغییرات ساختاری

دانلود پایان نامه

همکاران ۲۰۰۱).
از محلول OPA میتوان برای تعیین کمی قندی شدن پروتئین استفاده کرد. جذب این محلول در طولموج۳۴۰ نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده میشود. در شکل زیر نمایی از ساختار شیمیاییOPA را مشاهده میشود.

شکل ۳-۲- نمایی از ساختارشیمیایی ترکیبOPA.

۳-۲-۵- تهیه محلول فلورسامین
برای تهیه محلول فلورسامین مقدار مشخصی از پودر آن در حلال استونیتریل حل میشود تا غلظت نهایی آن ۱ میلیمولار شود. از محلول فلورسامین نیز میتوان برای تعیین میزان قندی شدن پروتئین استفاده کرد.
طیف نشری فلورسامین با استفاده از دستگاه فلورسانس و در طولموجهای ۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر خوانده میشود. این ترکیب در طولموج ۳۹۰ نانومتر برانگیخته میشود. در شکل زیر نمایی از ساختار ترکیب فلورسامین را مشاهده میکنید.

شکل ۳-۳- نمایی ازساختار شیمیایی ترکیب فلورسامین.

۳-۲-۶- تهیه محلول ANS
ANS یک نشانگر فلورسانسی است که به سطوح آبگریز پروتئین متصل میشود. این ترکیب زمانی که در طول موج ۳۶۵ نانومتر برانگیخته شود، دربازه طولموج ۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر نشر فلورسانس دارد (Barzegar و همکاران ۲۰۰۸).
برای تهیه محلول ANS، ۱۰ میکرولیتر از استوک اصلی ANS در ۹۹۰ میکرولیتر آب مقطر حل میشود و سپس این محلول فیلتر میگردد. ضریبجذب مولی ANS در آب مقطر M-1 cm-1 495 است. جذب در طولموج ۳۲۵ نانومتر به کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده می شود. آنگاه غلظت این ترکیب با استفاده از قانون بیرلامبرت تعیین میشود. در شکل (۳-۴) نمایی از ساختار ترکیب ANS آورده شده است.

شکل ۳-۴- نمایی از ساختار شیمیایی ترکیب ANS.

۳-۲-۷- تهیه محلول ABTS رادیکال
برای تهیه محلول رادیکالABTS مقدار معینی از پودر سبز رنگ این ترکیب در ۱ میلیلیتر آب مقطر حل میشود به طوری که غلظت نهایی آن ۷ میلیمولار شود. سپس مقدار معینی از پودر پتاسیم پر سولفات را وزن کرده به محلول ABTS اضافه میکنیم. غلظت نهایی پتاسیم پرسولفات در این محلول باید ۴۵/۲ میلیمولار باشد. این محلول را به مدت ۱۲ تا ۱۶ ساعت در دمای اتاق و در تاریکی نگهداری میشود تا پتاسیم پرسولفات ترکیبABTS را اکسید کرده و رادیکالهای آزاد ABTS ساخته شود (Re و همکاران ۱۹۹۸).
محلول رادیکال ABTS را میتوان به مدت ۲ روز در دمای اتاق و در شرایط تاریکی نگهداری و استفاده کرد. رادیکال ABTS در طولموجهای ۶۴۵، ۷۳۴ و ۸۱۵ نانومتر دارای بیشینهی جذب است که در این مطالعه از طولموج ۷۳۴ نانومتر برای بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی پپتیدهای حاصل از هضم کازئینهای قندی و غیرقندی استفاده شده است (Re و همکاران ۱۹۹۸، Salami و همکاران ۲۰۱۱).

شکل ۳-۵- تولید ABTS رادیکال در حضور پتاسیم پرسولفات.

۳-۲-۸- تهیه عصارهی ACE از پودر استون شش خرگوش
برای تهیه عصارهی ACE، ۱/۰ گرم از پودر استون شش خرگوش در ۱ میلیلیتر بافر تریس ۵۰ میلیمولار با ۲/۸pH، حاوی ۵ درصد گلیسرول مخلوط و سپس با هاون دستی به خوبی هموژن میشود. مخلوط به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری میشود. پس از گذشت زمان ۲۴ ساعت، مخلوط به مدت ۲۰ دقیقه با دور rpm2000 (در دمای ۴ درجه سانتیگراد) سانتریفیوژ میشود. پس از سانتریفیوژ، مایع قهوهایی رنگ شفاف فوقانی که حاوی مقدار زیادی آنزیم ACE است جدا کرده و تا زمان استفاده در دمای ۴ درجهی سانتیگراد نگهداری میگردد (Vermeirssen و همکاران ۲۰۰۲).

۳-۳- روش ها

۳-۳-۱- تخلیص بتا کازئین شیر گاو
برای جداسازی پروتئینهای کازئینی از پروتئینهای آبپنیر، ابتدا شیر تازهی گاو با استفاده از دستگاه سانتریفیوژ و با دور rpm7720 به مدت ۱۵ دقیقه (در دمای ۴ درجه سانتیگراد) چربیزدایی شد. سپس pH شیر با استفاده ازHCL (N2) به ۶/۴ کاهش یافت تا کازئینها در این pH که pH ایزوالکتریک این پروتئینها است، رسوب کرده واز پروتئینهای آبپنیر (Whey) جدا شود. رسوب کازئینی ۳ بار با استفاده از آب مقطر با دور rpm8400 به مدت ۶۰ دقیقه در دمای ۴ درجهی سانتیگراد سانتریفیوژ شد تا پروتئینهای آب پنیر به طور کامل جدا شود. در مرحلهی بعد رسوب حاصل با استفاده از دستگاه خشک کن انجمادی۴۹ پودر شد و پودر حاصل تا زمان استفاده در ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری میشود.
برای تخلیص کازئینبتا ابتدا ۱ گرم پودر کازئین در ۶۰ میلیلیتر بافر سدیماستات ۲۰ میلیمولار با ۶/۶ pH حاوی ۴ مولار اوره، ۳۵ میلیمولار EDTA و ۱۰ میلیمولار بتامرکاپتواتانول حل و سپس با دورrpm4500 به مدت ۲۰ دقیقه و در ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد.
محلول پروتئینی با ماتریکس DEAE- سلولز مخلوط و مخلوط حاصل به مدت ۲ ساعت روی شیکر در دمای ۴ درجه سانتیگراد هم زده شد (ماتریکس DEAE- سلولز از قبل با بافر سدیم استات ۲۰ میلیمولار به تعادل رسیده بود). در مرحلهی بعد مخلوط ماتریکس پروتئین به ستون انتقال داده شد و بعد از ۱۵ دقیقه خروجی ستون در لولههای فالکون ۵۰ میلیلیتری جمعآوری شد.
برای تعیین میزان خلوص پروتئین از SDS-PAGE احیایی (۱۲ درصد) استفاده شد. حجمهایی که بیشترین میزان خلوص را نشان دادند با هم مخلوط و بر علیه بافر ایمیدازول ۲۰ میلیمولار با ۳/۷ pH حاوی ۴ مولار اوره و ۱۰ میلیمولار بتامرکاپتواتانول دیالیز شد.آنگاه این مخلوط پروتئینی به ستون DEAE- سلولز که از قبل با بافر ایمیدازول ۲۰ میلیمولار به تعادل رسیده بود منتقل شد.
در این مرحله از شیب نمک سدیم کلرید با دامنه غلظتی۰تا ۲۵/۰ میلیمولار برای تخلیص پروتئین استفاده شد و خروجی ستون با سرعت ۱ میلیلیتر در دقیقه و در حجمهای
۴ میلی لیتر جمعآوری شد. آنگاه از روشSDS-PAGE درصد خلوص پروتئین مشخص گردید. سپس حجمهایی با بیشترین درصد خلوص پروتئین با هم مخلوط و برعلیه آب مقطر دیالیز شد. سپس پروتئین کازئینبتای خالص به کمک دستگاه خشککن انجمادی پودر شد (Barzegar و همکاران۲۰۰۸).
پودر کازئینبتا در دمای۲۰- درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری شد.

مطلب مشابه :  اشتغال زنان، زنان باردار، حق استمتاع

۳-۳-۲- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان
به منظور خالصسازی هموگلوبین، به ۹ میلیلیتر خون تازه، ۱ میلیلیتر سدیم سیترات ۴درصد اضافه میشود تا مانع از انعقاد آن گردد. سپس خون به مدت ۱۵ دقیقه و در دمای ۴ درجه سانتیگراد با دورrpm3000 سانتریفیوژ و محلول رویی دور ریخته میشود. در مرحلهی بعد به آن ۱۰ حجم محلول کلریدسدیم ۹/۰درصد اضافه میشود. آنگاه به مدت ۱۵ دقیقه در ۴ درجه سانتیگراد با دورrpm10000 سانتریفیوژ و مایع رویی دور ریخته میشود. به رسوب حاصل ۵ حجم بافرفسفات ۲/۰ مولار با ۴/۷pH اضافه میشود و دوباره به مدت ۱۵ دقیقه با دورrpm5000 در ۴ درجهی سانتیگراد سانتریفیوژ و مایع رویی خارج میشود. در ادامه به منظور هضم گلبولهای قرمز ۹ برابر حجم رسوب، آب مقطر سرد اضافه و به مدت ۱۰ دقیقه با دور rpm18000 سانتریفیوژ میشود. مایع رویی حاوی هموگلوبین میباشد، آن را جدا کرده و نمک آمونیوم سولفات ۲۰ درصد به آن اضافه میشود و پس از گذشت زمان ۱۵ دقیقه در دمای ۲ درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت با دورrpm 14000 سانتریفیوژ میشود. برای جدا سازی ترکیب ۲ و ۳ دیفسفوگلیسرات از هموگلوبین، محلول در بافرفسفات ۵۰ میلیمولار با ۴/۷pH به مدت ۱۲ تا ۲۴ ساعت دیالیز میشود. محلول هموگلوبین حاصل در دمای ۷۰- درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری میشود (Benesch و همکاران ۱۹۶۹، Riggs و همکاران ۱۹۸۱، Rossi و همکاران ۱۹۶۱، Romeo و همکاران ۲۰۰۳).
۳-۳-۳- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE
یکی از روشهای ساده، ارزان و معمول که برای تعیین میزان خلوص و وزنمولکولی پروتئینها استفاده میشود استفاده از الکتروفورز ژلی است (Phizicky و همکاران ۱۹۹۵). در SDS-PAGE به دلیل استفاده از سدیمدودسیلسولفات تمام پروتئینها بار منفی میگیرند. درنتیجه آنچه باعث افتراق و جدایی آنها از یکدیگر میشود اندازه و وزنمولکولی پروتئین میباشد که معمولا پروتئینهای کوچکتر و با وزنمولکولی کمتر با سرعت بیشتری طول ژل را طی می کنند. در این پژوهش برای تعیین میزان خلوص پروتئینهای کازئینبتا و هموگلوبین از ژل (۱۲ درصد احیایی) استفاده شد.

۳-۳-۴- تهیه پودر استون شش خرگوش
پودر استون شش خرگوش منبع مناسبی برای تهیه آنزیم ACE است (Lossow و همکاران۲۰۱۱). در این پژوهش ابتدا به کمک غلظت بالایی از ترکیب شیمیایی اتر خرگوشها بیهوش شدند. سپس بافت شش آنها خارج و با کلریدسدیم ۹/۰درصد شستشو داده شد. در مرحلهی بعد ششها با یک برابر حجم بافرفسفات ۰۱/۰ مولار با ۴/۷pH هموژن شدند و به مخلوط هموژن ۱۰ برابر حجم آن استون نگهداری شده در دمای ۲۰- سانتیگراد اضافه شد. این مخلوط ده دقیقه در فضای اتاق قرار گرفت. سپس این نمونه به مدت ۳۰ دقیقه با دورrpm5000 (در دمای ۴ درجه سانتیگراد) سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل با ۱۵ برابر حجم استون سرد مجددا به مدت ۳۰ دقیقه و با دورrpm5000 سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی دور ریخته شد و رسوب آن جمعآوری و روی کاغذ صافی واتمن پخش گردید و روی آن با ورقه آلومینیوم پوشانیده شد. پودر استون شش خرگوش در دمای ۴ درجه سانتیگراد خشک شد. پودر حاصل تا زمان استفاده دردمای۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری گردید (Lossow و همکاران ۲۰۱۱).

مطلب مشابه :  منبع پایان نامه ارشد دربارهانحراف معیار، توزیع فراوانی، پیش آزمون، وضعیت تحصیلی

۳-۳-۵- قندی کردن کازئینبتا و کازئینهای شیرگاو به روش غیرآنزیمی
برای قندی کردن پروتئینهای کازئینی از بافر فسفات ۱۰۰ میلیمولار با ۴/۷ pH، حاوی سدیم سیانوبوروهیدرات ۲۱۲ میلیمولار و دو قند گلوکز و لاکتوز با غلظت ۲۷۰ میلیمولار استفاده شد. مخلوط کازئین سدیم سیانوبوروهیدرات و قند به مدت ۱۲۰ ساعت در دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد و در شرایط تاریکی انکوبه شد. برای جلوگیری از رشد باکتری در محلول انکوبه از سدیمآزید با غلظت ۱/۰ میلیگرم در میلیلیتر استفاده شد. سدیم سیانوبوروهیدرات ترکیبی با خاصیت احیاکنندگی انتخابی است که باعث افزایش سرعت تولید و تبدیل حدواسطهایی موسوم به بازشیف به ترکیبات آمادوری میشود. بعد از گذشت زمان ۱۲۰ ساعت پروتئینهای قندی شده به مدت ۲۴ ساعت برعلیه آب مقطر دیالیز و به منظور تایید فرآیند قندی شدن از SDS-PAGE احیایی (۱۲ درصد) استفاده شد. (Lee و همکاران۱۹۷۹، Darewicz و همکاران ۱۹۹۸).

۳-۳-۶- آزمونهایOPA و فلورسامین برای تایید فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی
به منظور تایید قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینهای کازئینی از آزمون جذبی OPA و آزمون نشری فلورسامین استفاده شد.
ترکیب OPA بعد از اتصال به گروههای آزاد آمین پروتئین در طول موج۳۴۰ نانومتر دارای افزایش جذب میباشد. وقتی پروتئین قندی میشود به دلیل اتصال قند به گروههای آمین آزاد این ترکیب قادر به واکنش با این گروهها نیست و در نتیجه میزان جذب ۳۴۰ نانومتر پروتئین های قندی نسبت به انواع غیرقندی کاهش مییابد. غلظت پروتئین مورد استفاده ۵/۰ میلی گرم و مدت زمان انکوبه ۲ دقیقه در دمای اتاق بود (Church و همکاران ۱۹۸۳).
روش دوم برای تایید فرآیند قندی شدن استفاده از نشر فلورسانس فلورسامین است. نشر فلورسانس این ماده نیز با اتصال به گروههای آمین آزاد پروتئین افزایش مییابد. در نتیجه اگر گروههای آمین با قند واکنش داده باشند کاهش نشر در محدوده طولموجهای ۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر
دیده میشود (Sattarahmady و همکاران ۲۰۰۷).
در این روش ۲۵ میکرولیتر از پروتئین با غلظت ۱ میلیگرم در میلیلیتر با ۵۰۰ میکرولیتر بافرفسفات ۵۰ میلیمولار و ۲۲۵ میکرولیتر آب مقطر و ۲۵۰ میکرولیتر محلول فلورسامین به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق و در شرایط تاریکی انکوبه شد. سپس نشر فلورسامین با استفاده از دستگاه فلورسانس در بازه طولموجهای ۴۰۰ تا ۶۰۰ خوانده شد. در این مطالعه طولموج برانگیختگی ۳۹۰ نانومتر و شکافهای برانگیختگی و نشری به ترتیب ۵ و ۱۰ نانومتر بود.

۳-۳-۷- مطالعهی فلورسانس ذاتی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی
به منظور مطالعهی ساختار سوم بتا کازئینهای قندی و غیرقندی و تغییرات ساختاری حاصل از فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی از فلورسانس ذاتی و عارضی (با استفاده از نشانگرANS) استفاده شد.
برخی از مولکولها مانند پروتئینها به علت وجود آمینواسیدهای آروماتیک و اسیدهای نوکلئیک به دلیل داشتن حلقههای پورینی و پیریمیدینی به طور ذاتی دارای نشر فلورسانس هستند که از این خاصیت میتوان برای مطالعهی ساختار فضایی و تغییرات ساختارشان بهره برد.
معمولا برای ایجاد نشر فلورسانس اتمهای مولکول برانگیخته شده و به سطح بالاتری از انرژی میروند که در این سطح بسیار ناپایدار بوده و ضمن برگشت به سطح اولیه قسمتی از انرژی به صورت نشر فلورسانس و بخش دیگر آن به صورت گرما رها میشود. شدت فلورسانس را بازده کوانتمی مینامند (Q) و آن را از معادلهی زیر محاسبه میکنند.
معادله ۳-۲ تعداد فوتون جذبی/تعداد فوتون نشری=Q

نشر فلورسانس در محیطهای قطبی کاهش و در محیطهای غیرقطبی افزایش مییابد (Chamberlain و همکاران ۲۰۰۰).
برای مطالعهی فلورسانس ذاتی کازئینبتا از غلظت ۱۰ میکرومولار پروتئین و بافرفسفات ۱۰۰ میلیمولار با ۴/۷ pH استفاده شد. طولموج برانگیختگی ۲۹۵ نانومتر بود و طیف نشری در محدودهی طولموجهای ۳۰۰ تا ۵۰۰ نانومتر به وسیلهی دستگاه اسپکتروپولاریمتر (مدل Cary-Eclips، ساخت کشور استرالیا) دارای لامپ زنون و گزارشگر دادهای DR3108 در دمای اتاق ثبت شد. شکاف برانگیختگی و نشری به ترتیب ۵ و ۱۰ نانومتر بود.

۳-۳-۸- مطالعهی فلورسانس عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی
در این مطالعه از نشانگر فلورسانس ANS که قادر به اتصال به سطوح آبگریز پروتئین