سازمان بهداشت جهانی و منابع تجدیدپذیر

دانلود پایان نامه

مقدمه و هدف
1-بیان موضوع وهدف


1-1-ضرورت انجام تحقیق
طی چند دهه اخیر فناوری زیستی با استفاده از راهکارهایی نظیر کشت سلول، اندام و بافت ها، مهندسی ژنتیک و کاربرد نشانگرهای مولکولی قادرشده است کارآیی و بهره وری گیاهان دارویی را به عنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت ها و اندام های گیاهی امکان تکثیر سریع و انبوه بسیاری از گیاهان دارویی مهم را فراهم نموده است استفاده از کشت های درون شیشه به عنوان ابزار تولید ترکیبات دارویی دارای تاریخچه طولانی است. از زمانی که کشت بافت و کشت سلول ابداع شدند، محققین سعی نمودند از این تکنیک ها جهت تولید ترکیبات ارزشمند زیستی و مطالعه چرخه های بیوسنتز آنها استفاده نمایند در این میان ترکیبات آنتی اکسیدان به واسطه توجه خاصی که به آنها وجود دارد مورد بررسی قرار گرفتند در دهه های اخیر مشخص گردیده که تنش های اکسیداتیو سبب بروز بسیاری از بیماریهای ناشی از افزایش سن می باشد و مطالعات زیادی در جهت تولید ترکیبات آنتی اکسیدان انجام شده است.
آنتی اکسیدان ها ترکیباتی هستند که قادرند با اثرات مضر اما طبیعی فرآیند فیزیولوژیک اکسیداسیون در بافت ها مقابله کنند. در واقع این ترکیبات قادرند تنش های اکسیداتیو را خنثی کرده یا به تأخیر بیاندازند حتی اگر غلظت و مقدارشان کمتر از عوامل اکسیدکننده باشد، به نظر می رسد این ترکیبات در جلوگیری از ایجاد بیماریهایی مانند سرطان ، بیماری قلبی ، آلزایمر و … نقش دارند. در تحقیقات فراوانی خواص آنتی اکسیدانی اسانس های گیاهی همچون مرزه ، میخک، آویشن و … مشخص گردیده است. بسیاری از آنزیم ها و ترکیباتی با وزن مولکولی کم همچون توکوفرول ، گلوتاتیونو … نقش آنتی اکسیدانی دارند. گروه های دیگری از مواد مؤثره گیاهان دارویی همچون فلاونوئیدها نیز عملکرد مشابهی را از خود نشان داده اند. با توجه به قوانین سازمان بهداشت جهانی که بر استفاده از آنتی اکسیدان های طبیعی تأکید دارند. امروزه تولید آنها اولویت خاصی پیدا کرده است یکی از نقش های مهم متابولیت های ثانویه محافظت گیاه از آثار زیان آور و تنش های محیطی است. تولید متابولیت های ثانویه که دارای نقش آنتی اکسیدانی هستند در جهت جلوگیری از فعالیت گونه های واکنشگر اکسیژنی(ROS)است که در اثر تنش ها به وجود می آیند . بنابراین با استفاده بهینه از تنش ها می توانیم در جهت افزایش تولید ترکیبات آنتی اکسیدان قدم برداریم تنش های محیطی می توانند شامل تابش اشعه ماوراءبنفش ، خشکی ، صدمات فیزیکی و … باشند تابانیدن تشعشعات ماوراءبنفش بر روی کالوس های گیاه گل ساعتی سبب افزایش تولید فلاونوئیدها گردید علت این پدیده این است که فلاونوئیدها در گیاه نقش حفاظت کنندگی در برابر تشعشعات مضر مثل فرابنفش را دارند.
(مروری بر تولید ترکیبات آنتی اکسیدان در شرایط درون شیشه دومین جشنواره و نمایشگاه ملی گیاهان دارویی1394) کشت های درون شیشه به دلیل ویژگی هایی که دارند به عنوان یکی از راهکارهای تولید این ترکیبات در نظر گرفته شده اند. البته با وجود تلاش هایی که در30 سال اخیر جهت تولید درون شیشه ترکیبات دارویی انجام شده است تنها مقدار کمی از آنها تاکنون به مرحله تجاری سازی رسیده اند
تکنیک کشت بافت طی چند دهه گذشته به عنوان ابزاری کارآمد در ریزازدیادی، تکثیر، اصلاح و تولید گیاهان در شرایط کنترل شده درون شیشه ای در مراکز تحقیقاتی سراسر دنیا مورد استفاده قرار می گیرد. در واقع کشت بافت گیاهی را نمی توان شاخه ای مجزا از علومی نظیر ژنتیک، فیزیولوژی، باغبانی و غیره به شمار آورد بلکه کشت بافت ابزار مناسبی در خدمت سایر علوم بوده و به آنها در دستیابی به اهداف مورد نظر کمک می کند. در زمینه گیاهان دارویی نیز علاوه بر کاربرد آن در ریزادیادی، تکثیر، تولید و حفاظت از گیاهان دارویی باارزش و در خطر انقراض، طی دو دهه اخیر به عنوان ابزاری موثر برای تولید متابولیت های ثانویه در شرایط کنترل شده نیز مطرح می باشد. این آزمایش تلاش می کند تا با مطالعه مسیرهای بیوسنتزی متابولیتهای ثانویه در گیاهان دارویی، انتقال ژن و دخالت در بیوسنتز این ترکیبات، بهینه سازی تولید آنها در کشتهای کنترل شده سوسپانسیون سلولی و ریشه مویینه را تا مرحله نیمه صنعتی مورد مطالعه قرار دهد. از دلایل رویکرد به تولید ترکیبات آنتی اکسیدان در شرایط درون شیشه این است که برخی از ترکیبات آنتی اکسیدان را می توان به سادگی از محصولات زراعی و باغی است استحصال نمود و حتی امروزه از ضایعات حاصل از صنایع ماءالشعیر وروغن گیری زیتون که بسیار ارزان قیمت هستند جهت استخراج ترکیبات آنتی اکسیدان استفاده می کنند. اگر چه می توان برخی از این ترکیبات را به آسانی از منابع مختلف در دسترس تولید نمود ولی به دلایل ذیل رویکرد ویژه‌ای به تولید آنها در شرایط درون شیشه است که اهم این دلایل عبارتند از:
نبود امکان تولید مصنوعی برخی از این ترکیبات به دلیل ساختار پیچیده آنها
ارزش اقتصادی بالا با آن که هزینه اولیه تولید بالا است ولی تجربه نشان داده است که در مدت زمان کوتاهی جبران می گردد.
میزان ناکافی این ترکیبات در منابع گیاهی
محدودیت استفاده از منابع گیاهی در رابطه با گیاهان کمیاب ، در حال انقراض و گیاهانی که به صورت بی رویه از طبیعت برداشت می شوند
استخراج و خالص سازی این ترکیبات از کشت های درون شیشه آسان تر است
تولید ترکیبات جدیدی که تاکنون در گیاه مورد نظر وجود نداشته اند
تولید در مقیاس صنعتی به طوری که بتواند نیاز صنایع داروسازی و غذایی را تأمین کند به طور مثال به وسیله بیوراکتورها
عدم وابستگی به عوامل محیطی و فصول مختلف سال
امکان کنترل بیشتر و راحتتر مسیرهای بیوسنتز این ترکیبات
از استراتژی های افزایش تولید ترکیبات آنتی اکسیدان در شرایط درون شیشه ای:
افزایش بیوسنتز آنتی اکسیدان ها از طریق بهینه سازی شرایط کشت درون شیشه است نور یکی از فاکتورهای بسیار مورد توجه محققین در پژوهش های مختلف بوده و حتی سبب تولید آنتوسیانین های متفاوتی با شرایط طبیعی شده است . البته استفاده از نور به دلیل افزایش دمای محیط کشت و افزایش هزینه های تولید محدودتر شده است به طوری که در سال های اخیر استفاده از شرایط غیر وابسته به نور مورد توجه قرار گرفته است از جمله استفاده از دی اکسید کربن
2-1- استفاده از الیسیتورها و ایجاد شرایط تنش در جهت تحریک تولید ترکیبات
رزمارینیک اسید (RA) نوعی پلی فنول محسوب می گردد و متابولیت ثانویه گیاهی است که در خانواده نعناییان یافت می شودکه از 2 مولکول کافئیک اسید تشکیل شده است. این ترکیب دارای خواصی همچون ضدویروس، ضد باکتری و ضد التهاب است . همچنین اثرات محافظت کنندگی این ترکیب در مقابل تشعشعات یونیزان مانند پرتو فرابنفش مشخص گردیده است.
بیوسنتز این ترکیب با اسیدهای آمینه فنیل آلانین و تیروزینشروع می شود و تمامی هشت آنزیم درگیر در بیوسنتز آن شناسایی شده اند. تولید این ترکیب در کشت سوسپانسیون سلولی گیاهانی همچون گل گاوزبان وحشی ، آویشن شیرازی ، ریحان ، مریم گلی انجام شده است.
به منظور بهبود تولید رزمارینیک اسید در کشت سلول و بافت گیاهان حاوی این متابولیت بررسی شدکه با توجه به تولید بالای رزمارینیک اسید در کشت سلولی نسبت به کشت گیاه کامل در ابتدا کشت سلولی به عنوان روش بیوتکنولوژی برای تولید این متابولیت مورد توجه قرار گرفت و با استفاده از محرک های مناسب تولید آن بهبود یافت در مطالعات متعددی تولید رزمارینیک اسید (RA) در کشت کالوس برخی گونه های گیاهی بررسی شده و راهکارهای مختلفی مانند بهینه سازی محیط کشت به واسطه تغییر ترکیبات محیط تغییر شرایط فیزیکی (نور ، دما ، PH) و استفاده از محرک ها به کار گرفته شده همچنین کشت ریشه مویین به دلیل رشد سریع در محیط فاقد هورمون نگهداری آسان و تولید سطح بالاتر از متابولیت ثانویه نسبت به ریشه های طبیعی مورد توجه قرار گرفته است. نتایج مطالعات نشان می دهد که کشت ریشه مویین می تواند منبع تجاری باارزشی برای تولید (RA) باشد.
گیاه دارویی مرزه خوزستانی از جمله گیاهان باارزش و انحصاری فلور ایران است. عصاره های حاصل از گونه مرزه خوزستانی غنی از ترکیبات فنلی کارواکرولدر اسانس و اسیدهای فنلی آزاد بویژه رزمارینیک اسید در عصاره بوده و به همین جهت از فعالیت بیولوژیکی قابل توجهی برخوردار می باشند )هادیان و همکاران، 1387 )حضور ترکیبات فنلی با غلظت بسیار بالا و اثرات دارویی جالب توجه، این گیاه را به عنوان یک گونه کاندید باارزش برای استفاده در صنایع دارویی و غذایی به عنوان آنتی اکسیدان طبیعی مطرح می نماید. برای مصارف دارویی، در اکثر موارد تمامی قسمت های گیاه اعم از ریشه، ساقه، برگ و بذر از طبیعت جمع آوری شده و مشکلات جدی را برای بقای این گیاهان ایجاد می کند. از طرفی بذر بیشتر این گیاهان پروسه جوانه زنی پیچیده و مشکلی دارند، بنابراین اهلی کردن و کشت این گیاهان برای اهدافی همچون استخراج متابولیتهای اولیه و ثانویه، مشکلات بسیاری از قبیل اقلیم و فصل مناسب، آب کافی، بیماری ها و آفات و دست آخر کمبود منابع طبیعی (گیاهان مادری)در پیش رو دارد. این محدودیت ها محققان را بر آن داشته است تا از روش های کشت درون شیشه ای برای تولید مواد گیاهی بهره ببرند. همچنین سرعت رشد و محتوای پایین مواد مؤثره در بافتهای گیاهی و افزایش تقاضا برای این ترکیبات، ضرورت توجه به رویکردهای پربازده تولید را ایجاد کرده است. امروزه روشهای بیوتکنولوژی با رویکرد کشت بافت گیاهی در مقیاس انبوه یک روش مفید و مطمئن برای تولید متابولیتهای ثانویه نسبت به استفاده از کشت زراعی گیاه میباشد (Briskin, 2000) بسیاری از متابولیتهای ثانویه که توسط گیاهان تولید میشوند، توسط کشتهای کالوس و سلول نیز سنتز شده و به عنوان منابع مهمی برای تهیه ترکیبات با ارزش اقتصادی مورد استفاده قرار میگیرند. علم بیوتکنولوژی از طریق کشت سلول، بافت یا اندام، در شرایط درون شیشهای فرصتی را فراهم میکند تا ترکیب مورد نظر به دست آید. از آنجایی که پتانسیل و سرعت تولید این مواد در شرایط طبیعی بسیار محدود میباشد، از طریق کشت سلولهای گیاهی به روشهای مختلفی از جمله بهینه سازی شرایط کشت و استفاده از تکنیک انگیزش (مثل تنشها) می توان میزان تولید متابولیتهای ثانویه را افزایش داد (Ramachandra Rao and Ravishankar, 2002).
در بین تنشهای غیرزنده، تاثیر نور فرابنفش به عنوان یکی از فاکتورهای انگیزش در تحریک تولید متابولیتهای ثانویه بویژه ترکیبات فنلی در کشتهای درون شیشهای (اندام، کالوس و سلول)گزارشهای متنوعی وجود دارد. اخیراً اهمیت کشت کالوس مرزه خوزستانی به عنوان منبع تولید رزمارینیک اسید معرفی شده است (Sahraroo et al. 2014).
1-2- فرضیه‏های مطرح شده جهت انجام تحقیق
بین تاثیر تاریکی و افزایش ترکیبات فنولی رابطه مستقیم وجود دارد.