مقاله انتقال اطلاعات و مکان کنترل

دانلود پایان نامه

جهت بیان یک ژن نوترکیب لازم است که این ژن را درون یک میزبان مناسب کلون کنیم. کلون سازی ژن می تواند یک نمونه خالص از یک ژن منفرد را ایجاد کند. این ژن از همه ژن های دیگری که در حالت عادی در سلول وجود دارند، متمایز است. ( براون، 1995)
کلونینگ ژن به روش‌های مختلفی صورت می‌گیرد اما اساس همه‌ی آنها به این صورت است که DNA هدف از سلول دهنده استخراج می‌شود و با کمک آنزیم‌هایی برش داده می‌شود و به داخل یک مولکولDNA حلقوی، که معمولاً یک پلاسمید است و نقش ناقل ( وکتور ) را دارد، وارد می‌شود. به این ترتیب یک مولکول   DNAنوترکیب ساخته می‌شود. در مرحله‌ی بعد DNA نوترکیب را به سلول میزبان که اغلب نوعی باکتری می‌باشد منتقل می‌کنند. این مرحله را ترنسفورماسیون می‌نامند. DNA  نوترکیب در سلول میزبان همانند سازی می‌کند و همراه سلول میزبان تکثیر می‌شود. سلول‌های حاصل از تقسیم سلول میزبان اولیه، نسخه ‌هایی ازDNA نوترکیب همانند سازی شده را به ارث می‌برند. سلول‌ های باکتری به دنبال تقسیمات متعدد کلنی تشکیل می ‌دهند و از آنجا که اعضای این کلونی حاوی یک یا چند نسخه از ژن مورد نظر ما که در DNA نوترکیب حمل می‌شود می‌باشد، می‌توان گفت این ژن کلون شده است.
همان گونه که توضیح داده شد برای انتقال قطعه ژن نوترکیب به میزبان نیاز به حامل یا وکتور داریم. برای اینکه یک مولکول DNAبتواند به عنوان یک حامل کلون سازی عمل کند باید ویژگی های متعددی را دارا باشد. از همه مهم تر این که باید بتواند درون سلول میزبان همانند سازی کند تا به این ترتیب کپی های بسیاری از مولکول های DNA نوترکیب تولید شده و به سلول های دختر منتقل شود. همچنین یک حامل باید نسبتا کوچک باشد، به طور ایده ال کمتر از kb10 ، چرا که مولکول های بزرگ اغلب در تخلیص می شکنند و کار کردن با ان ها نیز بسیار مشکل است. از معدود مولکول‌های DNAای که این ویژگی‌ها را دارا می‌باشند، .پلاسمید ها هستند.پلاسمید ها مولکول های DNA حلقوی هستند که بطور مستقل در سلول های باکتریایی حضور دارند. پلاسمید ها تقریبا همیشه یک یا تعدادی ژن را حمل می کنند و معمولا این ژن ها یک شاخص مفید هستند که توسط باکتری میزبان نشان داده می شوند. برای مثال توانایی زنده ماندن در غلظت های سمی انتی بیوتیک ها مثل امپی سیلین یا کانامایسین، اغلب مربوط به حضور یک پلاسمید در باکتری است که ژن های مقاومت در برابر انتی بیوتیک را حمل می کنند. در ازمایشگاه، برای اطمینان از وجود یک پلاسمید ویژه در باکتری ، اغلب از مقاومت در برابر انتی بیوتیک به عنوان یک علامت انتخاب گر استفاده می شود.تمام پلاسمید ها دست کم دارای یک توالی DNA هستند که می تواند به عنوان یک منشاء همانندسازی (ori)عمل کند، بنابر این ان ها می توانند کاملا مستقل از کروموزوم اصلی باکتری، درون سلول تکثیر پیدا کنند.پلاسمید های کوچک، جهت همانند سازی خود از انزیم های سلول میزبان استفاده می کنند، در حالی که بعضی از پلاسمید های بزرگ تر حامل ژن هایی هستند که انزیم های مخصوص همانندسازی پلاسمید را خود کد می کنند.تعداد نسخه، به تعداد مولکول های یک پلاسمید منفرد که بطور طبیعی در یک سلول باکتری یافت می شوند اطلاق می گردد. بطور کلی تعداد نسخه های یک حامل کلون سازی مطلوب در سلول باید زیاد باشد تا مقدار زیادی مولکول DNA نوترکیب حاصل شود.
پلاسمیدها را براساس نوع ژنشان گروه‌بندی کرده‌اند:
الف-پلاسمیدهای بارور که به آنهاF پلاسمید می‌گویند این پلاسمیدها حاوی ژنی اند به نام ژن tra هستند که سبب انتقال اطلاعات ژنتیکی از طریق همیوغی به باکتری دیگر می‌شوند.
ب-پلاسمیدهای مقاومت یا Rپلاسمیدها که حاوی ژن‌های مقاومت به یک یا چند آنتی بیوتیک اند .
پ-پلاسمیدهای کشنده یا کولیسن سبب تولید پروتئین‌هایی می‌شود که برای باکتری‌های دیگر کشنده ‌اند.
ت-پلاسمیدهای بیماریزا مانند پلاسمیدTiدر ارگوباکتریوم تومفسیانس که باعث گال در گیاهان دولپه‌ای می‌شود.
ث-پلاسمیدهای تجزیه کننده که امکان تجزیه‌ی مولکول‌های غیر طبیعی نظیر تولوئن را به باکتری می‌دهند.
اندازه و تعداد نسخه پلاسمید ها زمانی که کلون سازی مد نظر است بسیار مهم می باشند. قبلا گفته شد که طول DNA کمتر از kb10 برای یک حامل کلون سازی مناسب است. اندازه پلاسمید ها بین kb1 تا بیش از kb250 متغیر است، بنابر این فقط تعداد کمی از ان ها برای کلون سازی مفید می باشند.
با توجه به مطالب ذکر شده، ما در این مطالعه از پلاسمید pet-28a استفاده کردیم که یک پلاسمید بیانی با شاخص ژن مقاومت به انتی بیوتیک کانامایسین می باشد. همانطور که ذکر شده پلاسمید های با اندازه کوچکتر از kb10 برای انتقال ژن مناسب تر هستند. پلاسمید pet28-a دارای bp5369 می باشد، پس از این جهت برای فرایند ترانسفورماسیون مناسب می باشد. به کمک خاصیت مقاومت به انتی بیوتیک ان می توان باکتری های نوترکیب را از باکتری هایی که پلاسمید را دریافت نکرده اند جدا نمود. از طرف دیگر این پلاسمید دارای عواملی است که جهت بیان ژن مورد نظر به ان نیاز دارد. منظور از این عوامل، توالی های نوکلئوتیدی کوچکی است که برای باکتری قابل شناسایی می باشد. این عوامل وجود ژن را به باکتری اطلاع می دهند و زمینه را برای ترجمه ژن مهیا می سازند. سه عامل مهم برای E.coli شامل پروموتر ، پایان دهنده و جایگاه اتصال ریبوزوم می باشد.
الف- پروموتر : نقطه ای که رونویسی از انجا شروع می شود را مشخص می کند. در E.coli پروموتر توسط زیر واحد سیگمای انزیم RNA پلی مراز شناسایی می شود.
ب- پایان دهنده : نقطه ای که امر رونویسی باید در ان پایان یابد را مشخص می کند. پایان دهنده یک توالی نوکلئوتیدی است که می تواند ایجاد یک (stemloop) داده و از ادامه رونویسی جلوگیری کند.
پ- جایگاه اتصال ریبوزوم : یک توالی نوکلئوتیدی کوتاه است که mRNA می تواند توسط ان به ریبوزوم اتصال یابد. کدون شروع کننده ژن در فاصله چند نوکلئوتیدی در پایین دست ان محل قرار دارد.
با وجود شباهت، غیرممکن است که RNA پلی مراز مربوط به E.coli قادر به اتصال به پروموتر یک ژن انسانی باشد و از انجا که E.coli قادر به تشخیص علامت های بیان کننده ژن های بیگانه نیست، یک ژن بیگانه در باکتری E.coli غیر فعال می ماند. برای حل این مشکل، این ژن باید تحت کنترل علامت های مربوط به E.coli قرار بگیرد تا باکتری قادر به تشخیص ان ها باشد. در این صورت ژن مربوطه قادر به نسخه برداری و ترجمه خواهد بود. وسیله هایی که این علامت ها را برای یک ژن خارجی فراهم می سازد به عنوان حامل های بیان شونده نامیده می شوند و با استفاده از این حامل ها است که یک ژن خارجی می تواند در سلول های E.coli یک پروتئین نوترکیب را تولید کند. پلاسمید pet-28a از جمله این حامل های بیان شونده می باشد.
پروموتر مهم ترین جزء در ساختمان یک حامل بیان شونده می باشد، به این دلیل که پروموتر اولین مرحله بیان ژن را کنترل می کند و ان اتصال انزیم RNA پلی مراز به mRNA می باشد. در نتیجه مقدار پروتئین نوترکیب به میزان زیادی بستگی به ماهیت پروموتر موجود در حامل بیان شونده دارد. پروموتر باید به دقت انتخاب شود. توالی 10- (TATAAT) و 35-(TTGACA) در E.coli ، (ConsensusSequence ) نامیده می شوند. با اینکه در اکثر باکتری ها پروموتر تفاوت زیادی با این توالی ندارند اما همین تفاوت اندک اثر زیادی بر کارایی عمل نسخه برداری دارد. پروموتر های قوی، پروموتر هایی هستند که باعث افزایش نسخه برداری می شوند و این پروموتر ها معمولا ژن هایی را کنترل می کنند که محصول عملی ان ها به میزان زیادی برای سلول لازم است، بر خلاف این پروموتر هایی که ضعیف هستند کارایی چندانی ندارند و عمل نسخه برداری ژن هایی را کنترل می کنند که محصول عمل ان ها به میزان کم مورد نیاز است. واضح است که حامل های بیان شونده باید حاوی پروموتر هایی قوی باشند تا ژن کلون شده بتواند به حداکثرمیزان ممکن نسخه برداری شود و نکته ی دومی که هنگام انتخاب یک حامل بیان شونده باید در نظر داشت این موضوع است که ایا به طریقی امکان کنترل این حامل وجود دارد یا خیر.
دو روش برای کنترل ژن در E.coliوجود دارد.
الف- القاء
ب- سرکوب
یک ژن القاپذیر ژنی است که نسخه برداری از ان با اضافه کردن یک ماده شیمیایی به محیط کشت شروع می شود. معمولا یک ماده شیمیایی سوبسترای انزیمی است که توسط ان ژن کد می شود. برعکس یک ژن سرکوب شدنی، ژنی است که با اضافه کردن یک ماده شیمیایی کنترل کننده خاموش می شود. کنترل ژن در تولید پروتئین های نوترکیب دارای اهمیت زیادی است، برای مثال اگر پروتئین های تولید شده برای باکتری تولید کننده مضر باشد، ساخت پروتئین باید به دقت تحت کنترل قرار بگیرد تا از انباشته شدن میزانی که برای سلول سمی محسوب می شود جلوگیری گردد و این امر با استفاده از مواد شیمیایی جهت کنترل میزان بیان ژن، ممکن خواهد بود. حتی اگر میزان پروتئین برای سلول باکتری اثر زیان اوری نداشته باشد باز هم کنترل کردن ژن لازم است زیرا نسخه برداری مداوم از یک ژن ممکن است بر قدرت تکثیر پلاسمید اثر بگذارد و باعث شود تا پلاسمید از سلول حذف شود. پروموتر های زیادی در E.coliوجود دارند که هم از قدرت مورد نیاز برخوردار هستند و هم قابل کنترل می باشند.
پلاسمید pet-28a دارای پروموتر lac که بیان پروتئین نوترکیب را کنترل می کند. این پروموتر یک توالی نوکلئوتیدی است که نسخه برداری از روی lacZ را کنترل می کند. این ژن تولید کننده انزیم بتاگالاکتوزیداز است. پروموتر lac با ماده ایزوپروپیل تیو گالاکتوزید ( IPTG) القاء می شود. درنتیجه با اضافه کردن این ماده شیمیایی به محیط کشت عمل نسخه برداری از روی ژن کلون شده اغاز می گردد. یک حامل بیان کننده ژن موثر و کارامد نه تنها به یک اغازگر قوی وقابل کنترل، بلکه به پایان گر و یک محل اتصال ریبوزومی هم احتیاج دارد. در اکثر حامل ها این علامت ها به صورت کاست هستند. به این دلیل به ان ها کاست گفته می شود که این علامت ها پشت سر هم قرار دارند و ژن خارجی در یک محل قابل شناسایی توسط انزیم های محدود کننده، در وسط این علامت ها قرار دارد.
در ایجاد مولکول DNA نوترکیب ابتدا لازم است DNA حلقوی حامل در نقطه ای بریده شده تا بتوان قطعه DNA مورد نظر را وارد ان نمود. در اینجا یک نوکلئاز کاملا اختصاصی لازم است و بدین منظور از انزیم های برش دهنده محدود کننده استفاده می شودماهیت برش حاصل از عمل اندونوکلئاز های برش دهنده در کلونینگ حائز اهمیت است. بسیاری از اندونوکلئاز های محدود کننده، DNA را از وسط برش داده و ایجاد پایانه صاف می کنند. سایر انزیم های محدود کننده طوری رشته ی DNA را برش می زنند که دو انتهای تک رشته ای ایجاد می شود که به ان انتهای چسبان می گویند.
با توجه به مطالب ذکر شده در طراحی ژن نوترکیب به این موضوع دقت شد که جایگاه هایی برای ابتدا و انتهای ژن نوترکیب انتخاب شود که در روی ناقل نیز این جایگاه ها وجود داشته باشد. با برش زدن متقابل پلاسمید pet28-aو قطعه ژن نوترکیب، انتها های چسبانی شکل می گیرد که به انتقال قطعه ژن نوترکیب به درون حامل مورد نظر کمک می کند.
هنگام استفاده از انزیم های محدود کننده باید نکاتی را رعایت کرد که برای کار کردن با این انزیم ها لازم است. بیشتر اندونوکلئاز های محدود کننده در 4/7 =PHبه خوبی عمل می کنند، ولی این انزیم ها در قدرت یونی متفاوت عمل می کنند. این قدرت یونی توسط NaClتأمین می گردد. غلظت یون منیزیم نیز اهمیت دارد. غلظت نامناسب NaClو یون منیزیم نه تنها باعث کاهش فعالیت می شود بلکه ممکن است باعث تغییراتی در ویژگی انزیم نیز شود. برای ایجاد محیط واکنش مناسب از بافر های انزیمی استفاده می شود که در مورد انزیم های XhoIو NcoI با توجه به دستورالعمل شرکت سازنده از بافر Tango2xا ستفاده شد. اخرین عاملی که باید مورد توجه قرار گیرد، درجه حرارت مناسب است. بیشتر اندونوکلئاز های محدود کننده در 37 درجه سانتیگراد بهترین عملکرد را دارا هستند که به کمک دستگاه انکوباتور ایجاد چنین شرایط دمایی به راحتی امکان پذیر است.
برای بررسی نتیجه هضم انزیمی اندونوکلئاز های محدود کننده، می توان از الکتروفورز بروی ژل اگارز استفاده نمود.از انجایی کهDNA مانند بسیاری از مولکول ها مثل پروتئین دارای بار بوده و هم چنین بار الکتریکی DNA منفی است، بنابر این هنگامی که مولکول های DNA در یک میدان الکتریکی قرار داده می شوند به قطب مثبت مهاجرت می کنند. که این میزان مهاجرت مولکول به دو فاکتور بستگی دارد. شکل و نسبت بار به جرم ان.الکتروفورز ژلی، مولکول های DNAرا بر اساس اندازه جدا می کند با توجه به این موضوع که اندازه ژن ناحیه مورد نظرbp662 است از ژل % 5/1 اگارز برای جداسازی ان استفاده کردیم.
قطعاتDNA حاصل از عمل آنزیم های محدود کننده به علت داشتن انتهای چسبنده )قسمتی که به صورت تک رشتهای است و با قطعه دیگر ساختمان مکمل تولید می کند(می توانند یکدیگر متصل شوند . با افزودن آنزیم لیگاز )وصل کننده( یپوند فسفو دی استر بین دو رشته بوجود می آید و دو قطعه محکم به یکدیگر متصل می شوند.آنزیم لیگاز در حضورATP و یاNAD+عمل می کند و با کسب انرژی لازم باعث ایجاد پیوند فسفو دیاستر در اسکلتDNA می شود . این آنزیم در همانند سازی DNA و باز ترکیبیDNA در داخل سلول نقش اساسی دارد . ابتدا تصور می شد که آنزیم لیگاز فقط قطعاتی را به هم متصل می کند که دارای انتهای مکمل باشند، اما قطعات DNAای که انتهای آنها فاقد قسمت های تک رشته ای هستند نیز اگر به میزان زیاد وجود داشته باشند توسط آنزیم لیگاز به هم وصل می شوند . با این حال احتمال اتصال قطعات فاقد قسمت های تک رشته ای بسیار کم است و اغلب قسمت های تک رشته ای مکمل به انتهای قطعات اضافه می شوند که این عمل تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین بازهای مکمل بین انتهاها را افزایش داده و عمل آنزیم لیگاز را آسانتر می کند.از آنجا که انتهاهای مکمل همواره به طور خودبخود با ایجاد پیوندهای هیدروژنی ساختمان مکمل می سازند، برای عمل آنزیم لیگاز لازم نیست که دو قطعه DNA قبلاً به هم وصل شده باشند.