مقاله اندازه گیری و بهینه سازی

دانلود پایان نامه

ذ- بعد از رسیدن نمونه ها به فصل مشترک ژل Stacking و ژل Running منبع تغذیه در 100 میلی آمپر تا رسیدن نمونه ها به انتهای ژل ، تنظیم شود.
3-6-2-4 رنگ آمیزی کوماسی بلو :
الف-پس از ران شدن نمونه ها بر روی ژل ، اسلایدهای شیشه ای را به آرامی از ژل جدا کرده ، و یکی از ژل ها را به منظور رنگ آمیزی با محلول کوماسی بلو در ظرف پلاستیکی با حدود ابعاد ژل قرار دهید.
ب-سطح ژل را با محلول کوماسی بلو پوشانده و به مدت 2 ساعت در دور آهسته بر روی شیکر قرار می گیرد.
پ-پس از این مدت زمان محلول کوماسی بلو را دور ریخته و ژل را با آب شستشو دهید تا رنگ های اضافی اولیه شسته شوند.
ت-سپس سطح ژل را با مقداری محلول رنگ بر پوشانده و به مدت 2 ساعت در دور آهسته بر روی شیکر قرار می گیرد.
ث-در صورت نیاز به رنگبری اضافی ، محلول رنگ بر دور ریخته شده ، سپس محلول رنگ بر تازه اضافه گردد. این عمل تا زمانی که باندهای آبی نمایان شود و ژل دوباره شفاف شود ، ادامه داده می شود.
برای نگه داری ژل می توان از محلول استیک اسید 7% استفاده نمود.
فصل چهارم : نتایج
4-1 نتایج حاصل از انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM
4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization
در توالی نوکلئوتیدی اولیه پارامتر هایی وجود داشت که کارایی سیستم بیانی در میزبان E.coliرا پایین می اورد. در نتیجه این پارامتر ها با جایگزینی نوکلئوتید های منا سب و ایجاد کدون هایی با راندمان بالا بهینه سازی شد.در تغییرات ایجاد شده نکات زیر مورد توجه قرار گرفت:
– هیچ اسید امینه ای تغییر نکند.
– با توجه به دو قسمتی بودن پروتئین مورد نظر، تا حد امکان ساختار هر بخش پروتئینی در شکل نهایی تغییر ننماید
– قالب خواندنی در ژن نهایی تغییر نکند.
– کدون هایی انتخاب شود که بیشترین بیان را در میزبان داشته باشد.
– پایداری mRNA مورد بررسی و توجه قرار گیرد.
– جایگاه های انزیم های محدود کننده در دو سر توالی بدون تغییر بماند.
پارامتر هایی که طی بهینه سازی دستخوش تغییر قرار گرفتند به شرح زیر می باشد :
1) شاخص سازگاری کدون یا ( CAI) :
از لحاظ کمی مقدار تمایل کدونی، کدون های مترادف با استفاده از شاخص سازگاری کدونی یاCAI اندازه گیری می شود که بین صفر تا یک متغیر است. زمانی که این شاخص برابر صفر باشد به این معنا ست که همه کدون های مترادف به یک میزان در یک ژن استفاده شده اند و مقدار برابر یک به معنای حداکثر بودن میزان تمایل کدونی بوده و در این مورد فقط کدون های بهینه مورد استفاده قرار گرفته اند که بالطبع آن نشان دهنده بیان بیشتر و دائم یک ژن و به عبارتی تعیین کننده سطح بیان آن خواهد بود. با توجه به این پارامتر میزان CAI برابر با یک، بهترین حالت بیانی ممکن و بیشتر از 8/0 ، حالت بیانی خوب و 6/0 ، حالت بیانی متوسط را دارا خواهند بود. در توالی اولیه طراحی شده میزان CAIبرابر با 62/0 بود که با تغییرات نوکلئوتیدی اعمال شده این میزان به 88/0 تغییر یافت. (شکل 4-1 )
شکل 4-1. شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی
بدین ترتیب میزان فراوانی کدون های بهینه(FOP ) نیز افزایش یافت به صورتی که کدون های کاملا اپتیموم برای توالی امینواسیدی در نظر گرفته شده از %44 در توالی اولیه به %68 در توالی بهینه شده افزایش یا فتند. دیگر کدون ها هم در بهترین حالتی که در توالی می توانستند حضور یابند به صورت بهینه در امدند. FOP اپتیموم نشان گر بیان کاملا دقیق کدون های کد کننده امینو اسید ها هستند، بدین معنی که با توجه به میزان تغییراتی که در کل توالی می تواند صورت گیرد، برای یک امینو اسید خاص، این کدون در میزبان بالاترین راندمان بیانی را می تواند داشته باشد. (شکل 4-2)
شکل 4-2 میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی
2) شاخص محتوای G-C
میانگین محتوای G-C یک توالی مناسب بین %30 تا %70 ( بطور میانگین % 50 ) می باشد. شاخص محتوای G-C توالی اولیه از میزان % 17/42 به % 69/47 در توالی بهینه سازی شده افزایش یافت که این امر سبب افزایش نیمه عمر mRNA ناحیه V می شود. (شکل 4-3 )