مقاله بهینه سازی و شیمیایی

دانلود پایان نامه

شکل 4-3. شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی.
با توجه به پارامتر های تغییر یافته، توالی 626 نوکلئوتیدی نهایی برای ژن ناحیه vپروتئین ALCAMدر شکل 4-4 نشان داده شده است. همچنین در شکل 4-5 نیز توالی اولیه و توالی بهینه سازی شده را بطور مقایسه ای و نوکلئوتید به نوکلئوتید می توان مشاهده کرد.
شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli.
شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده.
4-2 سنتز شیمیایی DNA ناحیه V
توالی طراحی شده کایمر مورد نظر توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد . این وکتور قبلا به نام pBMH شناخته می شد که طولی برابر با bp2907 دارد. این وکتور دارای ژن مقاومت به انتی بیوتیک امپی سیلین می باشد که می توان از ان برای جداسازی کلونی های نوترکیب استفاده کرد. طول توالی بعد از سنتز ژن به داخل پلاسمید به bp3575 رسید. توالی سنتز شده تمام مراحل کنترل کیفیت را با موفقیت گذارند. از جمله این مراحل می توان به موارد زیر اشاره کرد.
– تائید صحت توالی ژن نوترکیب
– تائید صحت توالی پلاسمید حامل
– تائید صحت شکل خواندن ( ReadingFrame ) در فرایند رونویسی
– تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی ( شکل 4-6 )
شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی
– تائید صحت قابلیت تکثیر ژن به کمک تکنیک PCRو عدم وجود هرگونه الودگی در ان
– کیفیت مناسب DNA سنتز شده به کمک تکنیک اسپکتروسکوپی و عدم وجود هرگونه الودگی در ان
– شکل ظاهری شفاف و عدم وجود هرگونه ذره ی خارجی در ان
سفارش مذکور به شکل پودر لیوفیلیزه و در حجم 10 میکروگرم دریافت شد و سپس بصورت استوک قابل استفاده با توجه به دستور العمل شرکت سازنده درامد. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیهVدر شکل 4-7 نمایش داده شده است. در این شکل جایگاه ژن مورد نظر، نحوه قرار گیری ان در پلاسمید حامل، جایگاه های انزیم های محدود کننده و همچنین جایگاه ژن مقاومت به انتی بیوتیک امپی سیلین نشان داده شده است.
شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیهV
4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیه VپروتئینALCAM
جهت تکثیر پلاسمید حاوی ژن سنتز شده ارسال شده توسط شرکت تولیدی، فرایند ترانسفورمیشن برای باکتری های کامپتنت E.coli سویه Top10 انجام شد و از کلونی های رشد کرده در محیط دارای انتی بیوتیک امپی سیلین، تک کلونی انتخاب شد و سپس از تک کلونی های انتخاب شده به روش لیز قلیایی استخراج پلاسمید صورت گرفت. جهت تائید حضور پلاسمید در محلول بدست امده، الکتروفورز انجام شد. با پدیدار گشتن باند bp3575 در ژل، حضور پلاسمید حاوی ژن ناحیهV پروتئینALCAM محرز گشت. در شکل 4-8 نتیجه حاصل از الکتروفورز محصول استخراج پلاسمید نشان داده شده است.
شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی ناحیهV پروتئینALCAM -از سمت راست چاهک اول نمونه پلاسمید حاوی ناحیه مورد نظر و چاهک دوم لدر DNA1kb-پیکان ابی باندbp3575 مربوط به پلاسمید حاوی ناحیه V و پیکان قرمز محل باند 3000bp لدر .
پس از این که وجود پلاسمید در محصول حاصل از استخراج پلاسمید کلونی های ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن سنتز شده ناحیهV پروتئین ALCAM تائید شد، به کمک تکنیک هضم دوگانه انزیمی، وجود ژن ناحیه VپروتئینALCAM در پلاسمید، با توجه به جایگاه های انزیمی NcoI و XhoI قرار داده شده در دو سر ژن سنتز شده مورد بررسی قرار گرفت. دو باند دلخواه bp662 ( ژن ناحیهV پروتئینALCAM ) و bp2907 ( پلاسمید pBSK ) نمایان گشت که تائیدی بر وجود ژن ناحیه مورد نظر در پلاسمید تکثیر شده دارد. شکل 4-9 نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید تکثیر یافته pBSK را نشان می دهد.
شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK حاوی ناحیه V – از سمت راست چاهک اول نمونه هضم انزیمی پلاسمید حاوی ناحیه V و چاهک دوم لدر DNA1kb –پیکان های قرمز از بالا پلاسمید (bp 2907) و ناحیه V (bp 662) –پیکان های سفید از بالا محل قرار گیری باند bp 3000 و 750bp لدر.
4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه V پروتئین ALCAM
جهت بیان ژن ناحیهV پروتئین ALCAMاز باکتری E.coli BL21(DE3)استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از ژل اگارز مرحله الکتروفورز خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligationبا پلاسمید pet-28a ترکیب شد . سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.Coli BL21 ترانسفورم شد. در شکل 4-10، نقشه ژنی پلاسمید pet-28aنشان داده شده است.
شکل 4-10. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a
این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین تشکیل کلونی می دهد. در شکل 4-11 کلونی های رشد کرده بر روی محیط کشت حاوی انتی بیوتیک کانامایسین بعد از ترانسفورماسیون باکتری BL21(DE3) با پلاسمید pet-28a حاوی ژن ناحیه Vرا نشان می دهد.
شکل 4-11باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن ناحیه V بروی محیط حاوی انتی بیوتیک کانامایسین