مقاله سانتریفیوژ و استخراج

دانلود پایان نامه

شکل3-8.کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز


روش کار :
1- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 منتقل می شود.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می شود.
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند .
نکته: برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم زده می شود تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکنندهبه مخلوط اضافه کرده سپس آن را 4 تا 6 بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود . این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می شود . سپس سریعا میکروتیوب چند بار سر و ته شود تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور ریخته شود.
9- محلول رویی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می شود . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می شود .
11- محلول روئی را دور ریخته می شود.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می شود.
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می شود .
14- مرحله قبل را یکبار دیگر تکرار شود .
15- محلول درون ستون را دور ریخته می شود.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ کرده تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار داده می شود و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می شود. بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
18- به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور ستون را در درون میکروتیوب5/1 سانتریفیوژ شود .
19- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK که حاوی ژن ناحیه V سنتز شده توسط کمپانی می باشد، با توجه به جایگاه های آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن سنتز شده می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز بوده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion
با توجه به سازه ی طراحی شده از دو آنزیم محدود کننده ی Nco1 و XhoI جهت تایید آنزیمی استفاده شد. مراحل انجام کار به شکل زیر است: