مقاله سانتریفیوژ و محتویات

دانلود پایان نامه

17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار داده و سپس بافر جدا کننده به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه شود . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.


18- به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور ستون در درون میکروتیوب5/1 سانتریفیوژ شود.
19- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید بیانی pet-28a که حاوی ژن ناحیه VپروتئینALCAM انتقال داده شده به ان به کمک تکنیک لایگیشن است وتایید وجود ان، با توجه به جایگاه های آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن ناحیه V پروتئینALCAM می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز بوده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده گردند.
3-5-6-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion و الکتروفورز
مراحل انجام کار به شکل زیر است:
1- یک میکروتیوب 2/0 برداشته و محتویات واکنش به صورت زیر در آن مخلوط گردد.
آب استریل: 12 میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI: 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI: 1 میکرولیتر
پلاسمید pet-28aنوترکیب: 2 میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:20 میکرولیتر
2- میکروتیوب به مدت 1 الی2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیوم واکنش آنزیم ها ) قرار داده شود.
3-الکتروفورز انجام داده تا قطعات پلاسمید و ژن ناحیه VپروتئینALCAMشناسایی وتایید شوند.
3-6 بیان پروتئین ناحیهVپروتئینALCAM
پس از تائید ترانسفورماسیون و وجود پلاسمید حاوی ژن ناحیه VپروتئینALCAMدر باکتری میزبان، با توجه به پروموتر lacدر پلاسمید pet-28a ، جهت القاء بیان پروتئین در باکتری از القاگر IPTGدر رقت مناسب استفاده شد.
3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک IPTG
مراحل کار بصورت زیر می باشد:
1) به 2 میلی لیتر از محیط کشت LBحاوی انتی بیوتیک کانامایسین ، λ20 از باکتری BL21(DE3)ترانسفورم شده اضافه شد و به مدت یک شب در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد و با سرعت rpm150 قرار داده شد وبه ان اجازه داده شد تا رشد کند.
2) λ 20 از مخلوط مورد نظر به 2 میلی لیتر از محیط کشت LBتازه حاوی انتی بیوتیک کانامایسین اضافه شد و به مدت 2 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با سرعتrpm150 قرار داده شد تا غلظت باکتری مورد نظر به ODبه 8/0 برسد. بدین طریق باکتری ها تازه گشته و در فاز لگاریتمی خود قرار دارند.
3) λ20 از القاگر IPTGبا غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر به 2 میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده اضافه شد و سپس به مدت 6 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با سرعت rpm150 قرار داده شد.
نکته: نمونه های کنترل منفی بدون افزوده شدن IPTGمورد بررسی قرار گرفتند.
4) مخلوط مورد نظر به مدت 5 دقیقه در 4 درجه و با سرعت rpm5000 سانتریفیوژ شد.
5) محلول روئی را دور ریخته و به رسوب ان λ60 اوره 8 مولار اضافه شد و به کمک تکنیک SDS-pageبیان پروتئین مورد نظر مورد بررسی قرار گرفت.