مقاله سانتریفیوژ و محتویات

دانلود پایان نامه

وقتی رنگ تا حدود 3/2 ژل پیشرفت کرد تانک را از منبع نیرو جدا کرده و ژل را به کمک دستگاه (Gel documentation) مورد بررسی قرار گرفت.
3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیه V پروتئین ALCAM
جهت بیان ژن ناحیه V پروتئین ALCAMاز باکتری E.coliBL21(DE3) استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از ژل اگارز مرحله الکتروفورز خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد . سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.ColiBL21 ترانسفورم شد.
3-5-1 تخلیص DNAناحیه V پروتئین ALCAM از ژل
برای تخلیص ازکیت استخراج DNA از ژل تولیدی شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد. (شکل 3-9 )
شکل 3-9.کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز
روش انجام ان بصورت زیر می باشد:
1- به کمک یک اسکالپل استریل، ناحیه ای از ژل که DNAناحیه V پروتئین ALCAMدر آن قرار دارد را جدا کرده و به قطعات کوچک تقسیم شود .
2- به 3/1 میلی گرم از ژل حاوی DNAنوترکیب ، 400 میکرولیتر Binding Bufferدر داخل یک میکروتیوب اضافه شود.
3- مخلوط را به داخل بن ماری 55 درجه انتقال داده و به مدت 5 دقیقه انکوبه کرده برای سهولت در ذوب شدن کامل ژل آن را هر 2 دقیقه هم زده شود .
4- 5 میکرولیتر سیلیکا به مخلوط اضافه شود.
5- 5 دقیقه در بن ماری 55 درجه قرار داده تا سیلیکا به خوبی حل شود.
6- به مدت 10 ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده تا سیلیکا رسوب کند . محلول رویی را دور ریخته شود .
7- 500 میکرولیتر washingbufferبه میکروتیوب اضافه کرده و به کمک ورتکس به خوبی مخلوط شود.
8- به مدت 10 ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی دور ریخته شود.
9- مرحله ی 7 و 8 را دوبار دیگر تکرار می کنیم تا تمام الکل موجود از مرحله ی قبل حذف شود ( الکل ممکن است از واکنش های آنزیمی مراحل بعدی جلوگیری کند).
10- 30 میکرولیتر بافر TEبه رسوب اضافه کرده و ورتکس کرده تا کاملا با محتویات میکروتیوب مخلوط شود .
11- میکروتیوب به مدت 5 دقیقه در 55 درجه قرار داده شود .
12- به مدت 1 دقیقه میکروتیوب را در 000/15 دور سانتریفیوژ کرده تا تمامی ترکیبات جامد ته نشین شود . اینک محلول رویی حاوی DNA تخلیص شده است.
3-5-2 لایگیشن
برای اتصال DNAناحیه V پروتئین ALCAM استخراج شده از ژل با پلاسمید بیانی pet-28a در آزمایشگاه از آنزیم لیگازاستفاده می شود که می تواند اتصالات فسفودی استری شکسته شده را ترمیم کند. این آنزیم از فاژ T4استخراج شده است و انرژی لازم برای فعالیت خود را از ATP تامین می کند و می تواند هم انتهاهای صاف و هم چسبنده را به هم متصل کند.
روش انجام این عمل به شکل زیر است:
1- محتویات واکنش بصورت زیر مخلوط شود.
بافر لایگیشن x10 : 3 میکرولیتر
آب استریل: 9 میکرولیتر
DNAلیگاز T4: 1 میکرولیتر