مقاله سهولت استفاده و ویژگیها

دانلود پایان نامه

تبدیل MTT به فورمازان


شکل 3-1
فرمول محاسبه MTT :
Vitality percent = ( Vital cells / Control cells ) × 100
فاکتورهای موثر در MTT:
۱-تعداد سلول: تعداد سلول بر حسب نوع سلول متفاوت است. معمولا برای سلولهای هیبریدوما، سلولهای توموری فیبروبلاست تعداد ۵۰۰۰ سلول برای هر ول استفاده می‌شود. اما هرچه تعداد سلول بیشتر باشد جذب نوری بالاتر خواهد بود. باید دقت کرد که اگر تعداد سلول بالاتر از حد لازم باشد باعث خطا در آزمایش خواهد شد.
۲-غلظت MTT: غلظت رنگ بسته به نوع سلول متفاوت است. معمولا غلظت ۵-۱ میلی گرم در میلی لیتر مورد استفاده قرار می‌گیرد.
۳-مدت انکوباسیون: معمولا ۴-۳ ساعت انکوباسیون سلولها همراه با رنگ کافی است. درموردی که احتیاج به تست سریع باشد می‌توان ۲ ساعت نیز انکوبه نمود.
۴-نوع حلال: معمولا از حلال ایزوپروپانل اسیدی و یا از حلال دی متیل سولفوکسید همراه بافر گلایسین، کلرید سدیم با ۵/۱۰PH= استفاده می‌شود.
۵-اثر بافرکلرید سدیم-گلایسین بر افزایش حلالیت: مطابق مطالعات، جذب نوری در حضور بافر گلایسین همراه دی متیل سولفوکسید بیستر از دی متیل سولفوکسید به تنهایی است.
۶-اثر PH بافرگلایسین بر حلالیت فورمازان: اگر فورمازون تنها در دی متیل سولفوکسید حل شود فقط دو جذب ماکزیمم می‌دهد ۵۱۰ و۵۷۰ نانومتر. در صورتیکه افزایش یابد منحنی به سمت راست متمایل می‌شود و فقط یک ماکزیمم می‌دهد، این ماکزیمم در۵/۱۰PH= اتفاق می‌افتد.
MTS، ترکیب مشتقی از MTT میباشد که خصوصیات فیزیکوشیمیایی مناسبتری دارد. مهمترین ویژگیهای ارزیابی سمیت سلولی به وسیلهی این ترکیب، سهولت استفاده، صحت بالا و شناسایی سریع سمیت میباشد(74).
بعد از کشت سلولها و در معرض قرار دادن آنها با عصارهها به مدت ۴۸ ساعت و در پلیتهای ۹۶ خانه، انکوباسیون سلولها (در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد واجد ۵٪ CO2) با محلول MTS به مدت ۴ ساعت انجام می‌شود. جذب این نمونه‌ها با کمک ELISA reader در طول موج ۴۹۰ نانومتر خوانده می‌شود. این جذب متناسب با میزان سلول‌های زنده می‌باشد (قانون بیر – لامبرت).
در این مطالعه، از کیت تعیین کمی رشد و تکثیر سلولی برپایه MTT شرکت سیگما (Sigma) استفاده گردید. تعداد پنج هزار سلول در داخل هر چاهک از پلیت 24 خانه کشت داده شد. ظرف کشت مذکور به‌مدت یک روز در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5 درصد دی‌اکسید کربن قرار داده شد تا سلولهای فیبروبلاستی بخوبی به پلیت بچسبند. آزمون MTT در ساعات 24 تا 72 ساعت پس از تابش لیزر انجام گرفت. بدین منظور در زمان مد نظر به هر چاهک پلیت، معادل 10% حجم محیط کشت (100 میکرولیتر) از محلول استریل MTT با غلظت 5 میلی گرم در میلی لیتر اضافه شد و ظرف کشت به مدت 3 ساعت در داخل انکوباتور قرار گرفت. بعد از تشکیل بلور‌های فورمازان، از محلول1/0 نرمالHCL در ایزوپروپانول به عنوان حلال استفاده شد. بعد از پیپتاژ کامل و حل شدن بلورها، جذب محلول بنفش رنگ به‌دست آمده در طول موج 570 نانومتر اندازه‌گیری گردید. از سلولهای فیبروبلاستی که به آنها تابش لیزر انجام نشده بود به‌عنوان کنترل استفاده شد.
آزمون Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
از این آزمون جهت تعیین بیان ژنهای نشانگر فعالیت فیبروبلاست استفاده شد. این آزمون در سه مرحله انجام می گردد: تخلیص RNA، سنتز cDNA و انجام RT-PCR
الف- تخلیص RNA:
از سلولهای گروه های تست و کنترل به این روش RNA جداسازی شد: برای تخلیص RNA، به پلیت سلولی حاوی 1 میلیون سلول، حجم ml 1 از محلول Trizol(QIAGEN) اضافه شده به مدت 5دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردید. محلول هموژن به لوله های اپندورف منتقل گردیده و یک پنجم حجم، کلروفرم به آن اضافه شد و لوله به مدت 30 ثانیه شدیداً تکان داده شده و سپس 5 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت. سپس با سرعت 12000دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ انجام گرفت. پس از سانتریفوژ 2 لایه تشکیل گردید که لایه بی رنگ بالائی حاوی RNA ولایه پائینی حاوی DNAو پروتئین می باشد. فاز بالایی که حامل RNA است با دقت زیاد و با استفاده از سر سمپلر های RNase free برداشته شده و به لوله جدید عاری از RNase منتقل شد. سپس ml 5/0 ایزوپروپانل به لوله های محلول RNA اضافه شده و لوله ها 1 ساعت در فریزر c ˚80- قرار داده شدند و پس از آن بلافاصله با سرعت 12000دور در دقیقه در دمای c ˚4 به مدت 10دقیقه سانتریفوژ انجام گردید. با دور ریختن مایع روئی رسوب RNA در ته لوله بدست می آید. زدودن باقیمانده های فنل با اضافه کردن ml1 اتانل 75درصد به رسوب RNA و سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه در 12000دور در دقیقه در دمای c˚4 انجام گرفت. در پایان RNA بدست آمده در µl 30 آب مقطر عاری از RNase حل شده و RNA تا در زمان سنتز cDNA در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
ب- سنتز cDNA:
جهت سنتز cDNA از کیت سنتز cDNA شرکت Fermentas استفاده گردید. 5 میکروگرم از محصول RNA استخراج شده در هر لوله طی مراحل زیر تبدیل به cDNA می گردد:
5 میکروگرم از RNA را با 2/0میکروگرم راندوم هگزامر مخلوط کرده و با آب عاری از ریبونوکلئاز به حجم 11 میکرولیتر رسانده شد .
مخلوط فوق در⁰ C 70 برای 5 دقیقه انکوبه شد و سپس فورا بر روی یخ منتقل شد.