مقاله محتویات و اطمینان

دانلود پایان نامه

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page
به منظور جداسازی باند های پروتئینی سلولی و ردگیری پروتئین نوترکیب در سلول های ترانسفورم شده و نیز میزان بیان پروتئین مورد نظر از الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریل امید استفاده شد و عصاره های سلولی تهیه شده بر روی SDS-pageالکتروفورز شدند. با توجه به این که وزن مولکولی پروتئین نوترکیب حدود 23 کیلو دالتون می باشد از ژل %15 استفاده کردیم . برای بررسی بیان پروتئین نوترکیب از کیت SDS-page ساخت شرکت سیتومتین ژن اصفهان استفاده شد.


3-6-2-1 محتویات کیت SDS-page
محلول ذخیره آکریل امید و بیس آکریل امید 40% : 40 میلی لیتر
محلول بافر Running 10X : 25 میلی لیتر
محلول بافر Stacking 10X : 10 میلی لیتر
پودر محلول ذخیره SDS 10% : 5 میلی لیتر
پودر محلول 10% آمونیوم پرسولفات (APS) : 5 میلی لیتر
پودر بافر Tank 10X : 400 میلی لیتر
محلول بافر 2X SDS gel loading : 2 میلی لیتر
محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو : 300 میلی لیتر
محلول رنگ بر کوماسی بلو : 400 میلی لیتر
محلول TEMED : 1 میلی لیتر
روش انجام SDS-page :
الف-اسلایدهای شیشه ای مخصوص ساخت ژل را به خوبی شسته و در نهایتا برای حذف هر گونه آلودگی به اتانول تمیز شود.
ب-سپس اسلایدهای شیشه ای در داخل سلول مخصوص خود قرار داده و برای اطمینان از عدم نشت ژل ، مقداری اتانول در اسلایدهای شیشه ای ریخته ، به مدت 10 دقیقه در آن قرار گیرد. در صورت عدم نشت با احتیاط ، اتانول واقع در اسلایدهای شیشه ای دور ریخته شود.
پ-بسته به وزن مولکولی پروتئین موردنظر بر اساس جدول 1 ، اقدام به ساخت ژل Running کنید.
نکته: ژل ساخته شده را در اسلاید شیشه ای ریخته تا حدی که 2 سانتی متر با سطح اسلاید فاصله داشته باشد. بلافاصله بعد از ریختن ژل ، بر روی سطح ژل ، ایزوپروپانول یا اتانول ریخته تا شرایط بی هوازی برای فعالیت TEMED فراهم شده و همچنین سطح ژل را صاف نماید. برای اطمینان از بسته شدن ژل ، مقدار اضافی ژل را در یک لوله اپندورف ریخته و درب آن را محکم ببندید.
بلافاصله بعد از اضافه کردن TEMEDنکته: ژل شروع به پلیمریزه شده می کند. بنابراین بایستی مواد به ترتیب از بالا به پایین اضافه شود و پس از اضافه کردن TEMED سریعا مخلوط و به فضای بین دو اسلاید شیشه ای اضافه شود. در هنگام ریختن ژل بین اسلایدهای شیشه ای از ایجاد حباب هوا بایستی جلوگیری شود.
ت- وقتی که ژل در داخل لوله اپندورف پلیمریزه شد (حدود 30 تا 60 دقیقه طول می کشد) ، ژل Stacking بر اساس جدول 2 ساخته شده ، ایزوپروپانول را از سطح ژل دور ریخته و سپس ژل Stacking را تا سطح اسلاید اضافه و بلافاصله شانه تفلونی بر روی اسلاید قرار گیرد.
ث- همانند مرحله قبل مقدار اضافی ژل را در یک لوله اپندورف ریخته و درب آن بسته می شود (مدت زمان بسته شدن همانند مرحله قبل)
ج-وقتی که ژل بسته شد ، در تانک در حدود 1 لیتر بافر 1X Buffer Running Tank ریخته و اسلایدهای شیشه ای را همراه با گیره آن درون تانک قرار دهید. پس از اینکه بافر تانک سطح ژل را کاملا پوشاند به آرامی شانه را از ژل خارج نمایید.
ح-در حین بستن ژل اقدام به آماده سازی نمونه ها شود به این صورت که نمونه ها را با نسبت برابر با بافر بارگذاری مخلوط و به مدت 7 دقیقه جوشانده شود.
خ-در چاهک نخست 5 میکرولیتر از مارکر پروتئین و در چاهک های بعدی ، بقیه نمونه ها ریخته شوند.
چ-درب تانک را بسته سپس منبع تغذیه به تانک وصل گردد.
د- منبع تغذیه را در 50 میلی آمپر تا زمانی که نمونه ها به فصل مشترک ژل Stacking و ژل Running برسد ، تنظیم شود.