مقاله محتویات و انتخاب

دانلود پایان نامه

1- ابتدا بافر مناسب برای هضم دوگانه آنزیم های NcoI و XhoI را به کمک سایت شرکت تولید کننده یعنی فرمنتاز لیتوانی انتخاب می شود . بهترین شرایط بافری برای این واکنش بافرx2 تنگو می باشد .
2- یک میکروتیوب 2/0 برداشته و محتویات واکنش را به صورت زیر در آن مخلوط شود
آب استریل: 12 میکرولیتر
بافر تنگو x2 :4 میکرولیتر
آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI : 1 میکرولیتر
پلاسمید : 2 میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:20 میکرولیتر
3- میکروتیوب به مدت 1 الی2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیوم واکنش آنزیم ها ) قرار داده شود .
3-4-5-2 الکتروفورز
جهت جداسازی قطعات حاصل از هضم دو گانه آنزیمی از الکتروفورز استفاده شود.
3-4-5-2-1 تهیه بافر 50xTAE
برای تهیه بافر TAE50xاز موارد زیر استفاده می شود:
TRIS : 5/60 گرم
EDTA 5/0 مولار ( در 8PH = ) :25 میلی لیتر
اسید استیک:28/14 میلی لیتر
آب استریل: به مقداری که حجم نهایی به 250 میلی لیتر برسد
حجم نهایی:250 میلی لیتر
نکته: برای اینکه بافر 50xTAEرا به بافر TAE1x مورد استفاده دربیاید باید در حجم مناسب رقیق شود .
3-4-5-2-2 تهیه ژل آگارز
برای جداسازی قطعات حاصل از هضم دوگانه آنزیمی از ژل آگارز Lowاستفاده شد . برای تهیه ی ژل 1.5 درصد آگارز0.6 گرم آگارز را در 40 میلی لیتر از بافر TAE1xحل کرده و با چرخاندن آرام ارلن به خوبی مخلوط شود . به مدت مناسب به کمک یک گرماساز آن را حرارت داده تا کاملا ذوب شود . این عمل تا آستانه جوشیدن ژل ادامه می یابد . باید دقت شود که ژل به طور کامل حل شده باشد .
پس از این که محلول آگارز به طور نسبی تا دمای 50 تا 60 درجه سرد شد ، رنگ گرین ویوئر را به میزان 2 میکرولیتر به آن اضافه کرده و به ظرف مناسب شانه دار منتقل و بعد از مدت 15 دقیقه در دمای محیط ژل کاملا آماده است . این ژل در حضور بافر TAE1xتا یک هفته در دمای 4 درجه قابل نگه داری است.
3-4-5-2-3 Runکردن نمونه
پس از بسته شدن کامل ژل، آن را درون تانک قرار می دهیم به نحوی که چاهک ها به سمت قطب منفی قرار گیرند . میزان بافر TAE 1xدرون تانک الکتروفورز باید به حدی باشد که به طور کامل روی ژل را بپوشاند.
نمونه را به همراه (loading dye) در درون چاهک ریخته و از یک مارکر وزن مولکولی kb 1 هم جهت شناسایی سایز قطعات در یکی از چاهکها استفاده شد .
تانک الکتروفورز را به منبع تولید ولتاژ وصل کرده و با ولتاژ 95 ولت و 55 آمپر الکتروفورز انجام داده شد .