مقاله مواد و روشها و اندازه گیری

دانلود پایان نامه

ه) تعریف واژه‌های کلیدی به فارسی:
لیزر کم توان: نوعی از انواع لیزرهای light-emitting diodes می باشد که دارای خواص درمانی است.
لثه (gingiva) : قسمتی از مخاط دهان که بلافاصله دندان رویش شده را در بر می گیرد.


فیبروبلاست ( Fibroblast): یکی از سلولهای اصلی لیگامان پریودنتال است.
: Proliferation تکثیر سلولی
فصل سوم
مواد و روش های تحقیق

مواد و روشها:
کشت سلولهای فیبروبلاستی
کشت رده سلولی فیبروبلاستی لثه (HGF3-PI 53) ((NCBI code: C502)) بر اساس پروتوکل کشت سلولی مندرج در ATCC انجام گرفت. به این منظور از محیط کشت Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) حاوی 10% سرم جنین گاو (FBS) استفاده گردید. به محیط کشت، 2 میلی مولار ال-گلوتامین ، 100 واحد در میلی لیتر پنی سیلین و 100 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین افزوده شد. سلولها در انکوباتور حاوی 5% CO2 و در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. تعویض محیط سلولها هر دو روز یکبار با استفاده از محیط کشت شرح داده شده در فوق انجام گرفت. بدین منظور محیط کشت رویی سلولها با استفاده از پیپت پاستور خارج گردیده و حجم 6 میلی لیتر محیط تازه به هر فلاسک 25 سانتی متر مربعی از سلولهای فیبروبلاستی افزوده گردید. پاساژ سلولها با استفاده از آنزیم تریپسین حاوی EDTA انجام گرفت (0.05% Trypsin; 0.53 mM EDTA). به این منظور سلولها با استفاده از بافر PBS بخوبی شستشو داده شده و سپس 1 میلی لیتر از محلول تریپسین به سلولهای چسبیده اضافه شد. پس از گذشت 3 دقیقه خنثی سازی آنزیم با کمک سرم جنین گاو انجام گرفت و پس از سانتریفوژ و افزودن محیط کشت تازه سلولها یک فلاسک به سه فلاسک منتقل شدند. جهت نگهداری سلولها از ضد انجماد DMSO به همراه 95% محیط کشت کامل استفاده شد. سلولها یک شب در دمای 80- درجه سانتی گراد فریز شده و سپس به تانک ازت مایع منتقل شدند. شمارش سلولها با استفاده از هماسیتومتر و میانگین سه بار شمارش انجام گرفت. برای اطمینان از زنده بودن سلولها قبل از آزمایش از رنگ حیاتی تریپان بلو با غلظت 4/0% استفاده گردید. رده سلولی HGF3-PI 53 از انستیتو پاستور و محیط کشت و سایر مواد از شرکت های گیبکو (Gibco) و سیگما (Sigma) تهیه شدند.
تابش لیزر کم توان
در این مطالعه از دستگاه لیزر کم توان گالیم – آلومینیوم- ارسناید (Ga–Al–As) با طول موج 810 نانومتر و توان ماکزیمم 50 میلی وات استفاده گردید (Advance Medical Manufacturing, Australia). سلولها به دو گروه تست و کنترل تقسیم شدند که در گروه تست به سلولها در سه روز متوالی در هر بار به میزان 4 ژول در هر سانتی متر مربع تابش انجام گرفت ولی بر روی گروه کنترل تابشی انجام نشد. به این منظور، مدت زمان 32 ثانیه به هر نقطه (با مساحت 4/0 سانتی متر مربع) تابش انجام گرفت. فاصله تقریبی بین لیزر تا سلولها 5 میلی متر تنظیم شد. از سلولهای مورد تابش قرار گرفته و کنترل در ساعات 24 ، 48 و 72 ساعت پس از تابش آزمون MTT به منظور بررسی پرولیفراسیون سلولی و در 72 ساعت پس از تابش آزمون RT-PCR به منظور بررسی بیان ژنهای نشانگر فعالیت سلول فیبروبلاستی انجام شد(72).
آزمون رشد و تکثیر سلولی
روش MTT
این روش برای اندازه گیری لنفوکاینهای پرولیفراتیو، میتوژن ها، لیز شدن با واسطه کمپلمان، تعیین فاکتورهای رشد سلول T و بررسی اثرات سایتوتوکسیسیتی مواد و داروهای مختلف بر روی سلولها به کار گرفته می‌شود. آزمون MTT از تست‌های آزمایشگاهی و استاندارد کالریمتریک (ارزیابی بر اساس تغییر رنگ )می باشد و برای اندازه گیری فعالیت آنزیم هائی که MTT را به فورمازان که رنگ ارغوانی دارداحیا می‌کنند، بکار می‌رود. MTT زردرنگ در سلولهای زنده به فورمازان احیا می‌شود(73). یک محلول قابل حل(معمولا”دی متیل سولفوکسید و محلول اسیدی اتانل یا یک محلول دترژانت مثل سدیم دودسیل سولفات در محلول رقیق شده اسیدکلریدریک) برای حل شدن محصول ارغوانی غیرقابل حل به محلول رنگی اضافه می‌شود. جذب این محلول رنگی بوسیله اندازه گیری در طول موج مشخص(معمولأ بین ۵۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر) به وسیله اسپکتروفتومتر تعیین می‌شود. ماکزیمم جذب بستگی به حلال استفاده شده دارد. این تبدیلات هنگامی که آنزیم ردوکتاز فعال هست انجام می‌شود از این رو اغلب برای اندازه گیری سلولهای زنده به کار می‌رود.
وقتی میزان فورمازان تولید شده توسط سلولهای تیمارشده با کنترل مقایسته شود کارایی عاملی که باعث مرگ یا تغییر متابولیسم سلولها می‌شود توسط منحنی در پاسخ مشخص می‌شود.
MTT
فورمازان
تبدیل MTT به فورمازان
MTT
فورمازان