مقاله نگهداری و سانتریفیوژ

دانلود پایان نامه

پلاسمید Pet-28a: 2 میکرولیتر


Insert(DNAناحیه V پروتئین ALCAM) :15 میکرولیتر
حجم نهایی: 30 میکرولیتر
نکته : در آخرین مرحله آنزیم DNAلیگاز T4اضافه شود.
2- به کمک دستگاه انکوباتور میکروتیوب حاوی مخلوط واکنش به مدت 4 ساعت در 16 درجه سانتیگراد سپس به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شد .
3-5-3 ترانسفورماسیون
بدین منظور از سویه E.coliBL21(DE3)که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده شد . این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین تشکیل کلونی می دهد .
3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته
1- باکتری در محیط کشت فاقد کانامایسین کشت داده شود.
2- پس از 24 ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را انتخاب کرده و به 5 میلی لیتر محیط LB مایع بدون کانامایسین تلقیح کرده و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار داده تا باکتری رشد کنند.
3- یک میلی لیتر از محیط فوق را به 5 میلی لیتر محیط LB تازه تلقیح نموده و مجددا در شیکرانکوباتور قرار داده شود . 2 تا 3 ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب 5/0 تا 8/0 در500 نانومتر را می دهد.
4- باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه دار شوند .
5- میکروتیوب ها 3 دقیقه در 900 دور سانتریفیوژ شود.
6- مایع روئی را دور ریخته و رسوب باکتری در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل شود .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور روی یخ انکوبه گردد .
8- این بار رسوب در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل شود .
9- 20 تا 30 دقیقه محلول روی یخ انکوبه گردد.
10- سپس محلول به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ شود .
11- رسوب در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل شود.
12- به مدت 20 دقیقه محلول بر روی یخ قرار داده شود.
این باکتری ها تا 72 ساعت روی یخ رد یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coliBL21(DE3) با محصول لایگیشن به روش شوک حرارتی
مراحل انجام کار به صورت زیر است:
1- ابتدا 100 میکرولیتر از سلول های مستعد E.coli BL21(DE3) روی یخ ذوب گردد.
2- 30 میکرولیتر از محصول لایگیشن را به 100 میکرولیتر از سلول های مستعد اضافه کرده به طوری که کاملا با هم مخلوط شوند.
3- این مخلوط به مدت 30 دقیقه بر روی یخ انکوبه گردد.