مقاله نگهداری و سانتریفیوژ

دانلود پایان نامه

4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار داده و بلافاصله به روی یخ منتقل و 5 دقیقه بدون حرکت روی یخ بماند.


5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB فاقد کانامایسین افزوده و به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار داده شود تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ شود.
7- 800 میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در 230 میکرولیتر باقی مانده، به خوبی حل گردد.
8- 230 میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LBآگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی داده، کاملا جذب محیط شده و سپس به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری گردد.
3-5-4 ارزیابی کلونی ها
پس از انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود 1 تا 2 میلی متر می رسد . یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر LBبراث کانامایسین دار تلقیح و به مدت یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه شود. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری Bl21(DE3)، پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژن ما را دریافت کرده است .
3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیه Vپروتئین ALCAM
جهت تایید وجود پلاسمید pet-28a در باکتری و عدم وجود هرگونه الودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید مورد نظر تایید شود، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت. مراحل انجام کار بصورت زیر است:
1- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 منتقل می شود.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ شود.
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند .
نکته: برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کنندهکه دارای RNAaseاست به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم زده شود تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه کرده سپس آن را 4 تا 6 بار سروته کرده تا کاملا مخلوط شود . این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه شود. سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته کرده تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب دور ریخته شود.
9- محلول روئی به ستون استخراج پلاسمید منتقل شود. این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ گردد.
11- محلول روئی دور ریخته شود.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه گردد.
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون سانتریفیوژ گردد.
14- مرحله قبل یکبار دیگر تکرار شود.
15- محلول درون ستون دور ریخته شود.
16- ستون به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ شده تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.