مقاله نگهداری و سانتریفیوژ

دانلود پایان نامه

4- باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه شود .
5- میکروتیوب ها 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ شود.
6- مایع رویی را دور ریخته و رسوب باکتری در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل شود .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور روی یخ انکوبه شود.
8- این بار رسوب در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل شود.
9- 20 تا 30 دقیقه محلول روی یخ انکوبه شود.
10- سپس محلول به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ شود.
11- رسوب در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل شود.
12- به مدت 20 دقیقه محلول بر روی یخ قرار گیرد.
این باکتری ها تا 72 ساعت روی یخ در یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیسرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10E.coli
بدین منظور از سویه E.coliTop10که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می شود . این باکتری به تنهایی حساس به آمپی سیلین است ولی وقتی وکتور را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی آمپی سیلین تشکیل کلونی می دهد .
3-4-2-1 روش کار:
مراحل کار به ترتیب زیر است:
1- 50 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی شایسته ابتدا روی یخ ذوب شود.
2- 2 میکرولیتر از پلاسمید AMP+-pBSK حاوی DNAناحیه VپروتئینALCAM به آن اضافه شود.
3- این مخلوط به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه گردد.
4- نمونه ها به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار داده و بلافاصله به روی یخ منتقل کرده و 5 دقیقه اجازه داده شود بدون حرکت روی یخ بماند.
5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB فاقد آمپی سیلین افزوده و به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار گیرد تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ گردد.
7- 700 میکرولیتر از مایع رویی را دور ریخته و رسوب را در 250 میکرولیتر باقی مانده خوب حل شود.
8- 100 میکرولیتر را روی یک پلیت LB آگار و 150 میکرولیتر را روی یک پلیت دیگر دارای LB آگار آمپی سیلین دار ریخته و کشت سه قسمتی کرده، اجازه داده شود کاملا جذب محیط شده و سپس به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری گردد.
3-4-3 ارزیابی کلونی ها
پس از انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود 1 تا 2 میلی متر می رسد . یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر LB براث آمپی سیلین دار تلقیح کرده و به مدت یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه گردد. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری، پلاسمید حاوی ژن ما را دریافت کرده است .
3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیهVپروتئین ALCAM
اساس استخراج پلاسمید مبتنی بر لیزقلیایی و متعاقب آن جذب DNA توسط سیلیکا و سپس جداسازی پلاسمید از ستون می باشد . برای استخراج پلاسمید از کیت تهیه شده از شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد . ( شکل 3-8 )