مقاله پایداری و نگهداری

دانلود پایان نامه

ت-از بین بردن نواحی برش ناخواسته
ث-جایگاه هایآنزیمی آنزیم های محدودالاثر که ممکن است در فرایند کلونینگ اختلال ایجاد کنند.
ج-به حداقل رساندن نواحی تکرار شونده مستقیم یا غیر مستقیم
3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه V پروتئین ALCAM
3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب
توالی طراحی شده کایمر مورد نظر توسط شرکت Biomatikکانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد .
3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNAسنتز شده
DNAلیوفیلیزه شده می تواند توسط بافر TEاستریل یا آب بدون نوکلئاز در PHطبیعی با توجه به امکانات محیط آزمایشگاه بصورت محلول تهیه شود . بعد از محلول سازی می توان آن را در دمای بین20- تا 80- درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری کرد . DNA لیوفیلیزه شده، محلول شده به کمک بافر TEمی تواند به مدت 6 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود در حالی که اگر از آب برای محلول سازی استفاده شود امکان نگهداری در 4 درجه سانتیگراد وجود ندارد.
3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه
قبل از باز کردن تیوب حاوی DNA ، ابتدا به مدت کوتاهی تیوب سانتریفیوژ شد تا DNA های متصل به دیواره جدا شوند . در صورت عدم سانتریفیوژ ممکن است مقداری از ذخیره ی DNA از دسترس خارج شود.
الف- استوک اصلی: µg10 از DNAلیوفیلیزه در µg100 از بافر TEحل شد.
TEاز بافر10µg از استوک اصلی در1µg ب- استوک مورد استفاده: در یک میکروتیوب دیگر
10رسید) ng/ µlحل شد.(غلظت نهایی به
3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیه v پروتئین ALCAM
جهت تکثیر پلاسمید حاوی ژن ناحیه Vپروتئین ALCAM مراحل زیر طی شد:
3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته
جهت اماده سازی باکتری Top 10برای پذیرش پلاسمید ابتدا باید ان را کامپتنت یا شایسته سازی، برای پذیرش پلاسمید کرد.
3-4-1-1 مواد و محلول ها
محلول کلرید کلسیم 0.1 مولار
LB براث بدون آنتی بیوتیک
LB براث حاوی آمپی سیلین ( پس از ساختن براث و سپس سرد شدن ان بعد از اتوکلاو کردن، آمپی سیلین به محیط کشت افزوده شد . )
LB آگار حاوی آمپی سیلین ( روش تهیه دقیقا مشابه LB براث است )
3- 4-1-2 روش کار
1- باکتری در محیط کشت فاقد آمپی سیلین کشت داده شد.
2- پس از 24 ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را انتخاب کرده و به 5 میلی لیتر محیط LB مایع بدون آمپی سیلین تلقیح کرده و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار داده تا باکتری رشد کنند.
3- یک میلی لیتر از محیط فوق را به 5 میلی لیتر محیط LB تازه تلقیح نموده و مجددا در شیکرانکوباتور قرار می شود . 2 تا 3 ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب 5/0 تا 8/0 در500 نانومتر خواهد داشت.