تغییرات ساختاری

است، استفاده شد. در این مطالعه غلظت پروتئین ۱۰ میکرومولار و غلظت ANS 100 میکرومولار انتخاب شد. فرآیند انکوبه به مدت ۳۰ دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق انجام شد. طولموج برانگیختگی ۳۶۵ و نشر در بازه طولموجهای ۴۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر ثبت گردید. شکاف برانگیختگی و نشری نیز به ترتیب ۵ و ۱۰ نانومتر بود (Barzegar و همکاران ۲۰۰۸).

۳-۳-۹- مطالعه تغییرات ساختاری کازئینهای بتای قندی و غیرقندی، با استفاده از دستگاه دورنگنمایی دورانی
به منظور بررسی تغییرات ساختار دوم کازئینبتا ضمن قندی شدن غیرآنزیمی از دستگاه دورنگنمایی دورانی مجهز به سیستم دمایی و محدودهی دور فرابنفش(Far-UV CD) بین طولموجهای ۱۹۰ تا ۲۵۰ نانومتر استفاده شد.
در این مطالعه از بافرفسفات ۲۵ میلیمولار با ۵/۷ pH و غلظت ۴/۰ میلیگرم بر میلیلیتر پروتئین استفاده شد. تمام اندازهگیریها در دمای ۲۵ درجهی سانتیگراد انجام گردید. کازئین بتا دارای ۲۰۹ آمینواسید و وزنمولکولی ۲۴۰۰۰ دالتون میباشد در نتیجه برای تعیین بیضیت مولاری۵۰ از معادلهی (۳-۶) استفاده شد (Kelly و همکاران ۲۰۰۵).
معادلهی ۳-۳ /CL)[θ]λ = (۱۰۰.(MRW).[θ]obs

در این معادله λθ بیضیت مشاهده شده در یک طولموج خاص، C غلظت پروتئین بر حسب میلیگرم بر میلیلیتر، L طول مسیر عبور نور بر حسب سانتیمتر، MRW میانگین وزن باقی ماندههای آمینواسیدی در زنجیرهی پلیپپتیدی که از فرمول M/(N-1) محاسبه میشود (M وزن مولکولی زنجیرهی پلیپپتیدی بر حسب دالتون و N تعداد آمینواسیدها در زنجیرهی پلی پپتیدی است) میباشد.
پس از محاسبهی بیضت مشاهده شده برای پروتئین این بیضیت از بیضیت بافر کم شده و نتایج بدست آمده توسط نرم افزار CDNN51 آنالیز و میزان ساختار دوم پروتئین براساس درصد بیان شد (Bohem و همکاران ۱۹۹۲).

۳-۳-۱۰- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی
برای مطالعهی فعالیت چاپرونی از انسولین با غلظت ۳/۰ میلیگرم در میلیلیتر و هموگلوبین با غلظت ۵/۰ میلیگرم در میلیلیتر به عنوان پروتئین هدف استفاده شد. برای تودهایی کردن انسولین از ترکیب شیمیایی DTT (20 میلیمولار) و برای تودهایی کردن هموگلوبین از استرس دمایی (۵۷ درجهی سانتیگراد) استفاده شد. غلظت کازئینبتا ۰۵/۰، ۱/۰ و ۲/۰ میلیگرم در میلیلیتر انتخاب شد. مدت زمان انکوبه ۵ دقیقه در دمای اتاق بود و جذب در ۳۶۰ نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر مدل +T90 به مدت ۱۵ دقیقه خوانده شد. در این آزمایش از بافرفسفات ۵۰ میلیمولار با ۴/۷pH استفاده شد.

۳-۳-۱۱- هضم کازئینهای شیرگاو و کازئینبتای قندی و غیرقندی به وسیلهی آنزیمهای تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی
در این مطالعه ازآنزیمهای تریپسین (EC.3.4.21.4) و کیموتریپسین پانکراس گاوی (EC.3.4.21.1) استفاده شد. غلظت پروتئین ۲ و ۵ میلیگرم در میلیلیتر و بافر مورد استفاده بافر فسفات ۲۰ میلیمولار با ۸/۷pH بود. مدت زمان هضم ۲ و ۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و در تاریکی انتخاب شد. در پایان آنزیمها در دمای ۸۵ درجهی سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه غیر فعال شد. برای تایید فرآیند هضم کازئینها از SDS-PAGE (15 درصد) و آزمونOPA استفاده شد.
فرآیند هضم پروتئین با افزایش گروههای آمین آزاد همراه است. در نتیجه با افزایش میزان هضم جذب OPA محلول کازئینی درطولموج ۳۴۰ نانومتر زیاد میشود، که میتواند تاییدی بر هضم پروتئین باشد (Church وهمکاران ۱۹۸۳، Pralea و همکاران ۲۰۱۱).
برای محاسبهی درجه هضم از معادله زیر استفاده شد.
معادله۳-۴

ΔAتغییرات جذب در طولموج ۳۴۰ نانومتر، M وزن مولکولی پروتئین برحسب دالتون، d فاکتور رقت، ε ضریبجذب مولیOPA وقتی به گروه آمین اسیدهای آمینه متصل میشود و برابر با Mol-1 cm-16000، C غلظت نمونه و N تعداد کل پیوندهای پپتیدی میباشد.

۳-۳-۱۲- مطالعهی فعالیت آنتیاکسیدانی کازئینهای شیرگاو وکازئین بتای قندی و غیرقندی
برای انجام این مطالعه از بافرفسفات ۵ میلیمولار با ۴/۷pH ، محلول رادیکال +ABTS و غلظت های ۲۵، ۵/۳۷ و ۵۰ میکروگرم در میکرولیتر پروتئین استفاده شد. تغییرات جذب در ۷۳۴ نانومتر به وسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر و در مدت ۶ دقیقه ثبت شد. در این مطالعه حجمی از محلول ABTS به کووت اضافه شد که جذب آن در ۷۳۴ نانومتر برابر ۰۲/۰± ۷/۰ باشد. از محلول ترولوکس به عنوان کنترل مثبت استفاده شد و فعالیت آنتیاکسیدانی نمونهها برحسبTEAC(μΜ) بیان شد. از معادلهی (۳-۵) برای تعیین درصد مهار رادیکالهای آزاد استفاده شد (Fan و همکاران ۲۰۱۲).
معادله ۳-۵ ۱۰۰ (AC/ AS-1)% Inhibition=

برای بیان فعالیت آنتیاکسیدانی نمونه ها برحسب TEAC(μM)52 نمودار استاندار ترولوکس با غلظتهای ۰ تا ۱۵ میکرومولار رسم و شیب نمودار آن به وسیله نرمافزار Excel تعیین شد. همچنین نمودار غلظت بر درصد مهار نمونهها رسم و شیب آن به وسیله نرمافزار Excel محاسبه گردید. از تقسیم شیب نمودار نمونهها برشیب نمودار ترولوکس فعالیت آنتیاکسیدانی معادل ترولوکس نمونهها بدست آمد (Re و همکاران۱۹۹۸).

مطلب مشابه :  مجلس شورای اسلامی، مجلس خبرگان قانون اساسی، اشتغال زنان، موازین اسلامی

شکل ۳-۶- نمونهایی از نمودار استاندارد ترولوکس.

۳-۳-۱۳- مطالعهی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینهای بتای قندی و غیر قندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها
به منظور مطالعه مهار آنزیم ACE سوبسترای این آنزیم موسوم بهN-(3-(2-فوریل (اکریلویل)-فنیل آلانین-گلایسین-گلیسین۵۳ (۱ میلیمولار) در ب
افر تریس با غلظت۵۰ میلیمولار و دارای ۴۰۰ میلیمولار سدیم کلرید با ۳/۸pH حل شد. غلظت سوبسترا ۱ میلیمولار بود. سپس ۱۵۰ میکرولیتر از سوبسترا در هر چاهک ریخته شد.
در ادامه ۵۰ میکرولیتر از نمونهی پروتئین به چاهک اضافه و به مدت ۲ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد، و در پایان به هر چاهک ۱۰ میکرولیتر از عصارهی آنزیم ACE که از شش خرگوش استخراج شده بود اضافه گردید. آنگاه تغییرات جذب به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و در طولموج ۳۴۰ نانومتر خوانده شد (Vermeirssen وهمکاران ۲۰۰۲). درصد مهار آنزیم ACE از معادلهی (۳-۶) محاسبه شد (Lahogueو همکاران ۲۰۱۰، Asoodeh و همکاران ۲۰۱۱).
معادله ۳-۶

۳-۳-۱۴- مطالعهی فعالیت آلرژیزایی کازئینها و کازئینبتای قندی و غیرقندی
در این مطالعه از کیت استاندارد سنجش آلرژی ساخت شرکت Rbiopharm,Germany، سرم خون کودکان حساس به شیرگاو و روش الایزای غیرمستقیم۵۴ برای بررسی توان آلرژیزایی کازئینها و کازئینبتا قندی و غیرقندی و همچنین پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی
آنها استفاده شد.
ابتدا ۲۰۰ میکرولیتر از هر نمونهی پروتئینی که علیه بافرفسفات سالین ۰۱/۰ مولار با ۴/۷pH دیالیز شده بود با غلظت ۱ میلیگرم در میلیلیتر به هر چاهک که حاوی کاغذ نیتروسلولز بود، اضافه شد. سپس مجموعه به مدت یک شبانه روز در دمای ۴ درجه سانتیگراد انکوبه شد. در مرحلهی بعد پلیت مربوطه به وسیلهی بافرفسفات سالین ۰۱/۰ مولار با ۴/۷pH که حاوی ۱/۰ تووین-۲۰ بود (بافرشستشو) ۳ بار شسته شد، تا پروتئینهایی که به پلیت متصل نشدهاند از آن خارج شوند. در ادامه ۲۰۰ میکرولیتر بافر مسدود کننده که حاوی تووین ۲۰ و ۳ درصد سرمآلبومین گاوی۵۵ بود به هر چاهک اضافه شد و پلیت به مدت ۲ ساعت در دمای اتاق انکوبه گردید. مجددا پلیت ۳ مرتبه با بافر شستشو، شسته شد و در ادامه ۵۰ میکرولیتر از سرم خون بیماران (بدون رقیق سازی) به هر چاهک اضافه و پلیت به مدت یک ساعت در دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد انکوبه شد. پس از گذشت این زمان مجددا پلیت با بافرشستشو، ۳ مرتبه شسته شد. در مرحلهی بعد،۵۰ میکرولیتر آنتیبادی ثانویه که به آنزیم آلکالین فسفاتاز متصل بود به هر چاهک اضافه و به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجهی سانتی گراد انکوبه شد. در انتها ۱۰۰ میکرولیتر از سوبسترای نیتروفنل فسفات به هر چاهک اضافه و به مدت ۱۵دقیقه در دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد انکوبه شد. سپس ۵۰ میکرولیتر از محلول متوقف کنندهی واکنش به هر چاهک اضافه و در پایان جذب نمونهها درطولموج ۴۰۵ نانومتر خوانده شد (Pourpak و همکاران ۲۰۰۴، Walsh و Sutton 1984، Walshو Wrigley 1984).

۳-۳-۱۵- آزمون آماری
در این پژوهش از نرم افزارSPSS و آزمون آماری t-test برای تجزیه و تحلیل دادهها استفاده شد و P۰.۰۵ در نظر گرفته شد.

فصل چهارم

بحث و نتیجهگیری

۴-۱- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیتهای زیستی (چاپرونی، آنتیاکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژیزایی کازئینبتا

۴-۱-۱- تخلیص پروتئین کازئین بتا
جهت تخلیص کازئینبتا از شیر تازهی گاو، پس از چربیزدایی شیر از ۲ بافر ۲۰ میلیمولار استاتسدیم با ۶/۶ pH ، حاوی ۴ مولاراوره ، ۳۵ میلیمولارEDTA و ۱۰ میلیمولار بتامرکاپتو اتانول و بافر ۲۰ میلیمولار ایمیدازول با ۳/۷pH حاوی اوره ۴ مولار و ۱۰ میلیمولار بتامرکاپتواتانول استفاده شد. سپس غلظت پروتئین در مرحلهی اول تخلیص به وسیلهی آزمون برادفورد ( Bradford و همکاران ۱۹۷۶) و در مرحلهی بعد با استفاده از ضریبجذب مولی پروتئین و به کمک معادلهی بیرلامبرت تعیین شد.
میزان خلوص پروتئین در هر مرحله از تخلیص با استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی (۱۲درصد) و رنگآمیزی کوماسی بلو تعیین شد. شکل (۴-۱-۱) نمایی از ژل SDS-PAGE پروتئین کازئین بتا در هر یک از مراحل خلوص را نشان میدهد.

مطلب مشابه :  پایان نامه درمورداختلالات خواب، بهداشت روان

شکل۴-۱-۱- نمایی از SDS-PAGE احیایی (۱۲ درصد)مراحل خالصسازی پروتئین کازئین بتا. شکل A مرحلهی اول تخلیص با استفاده از بافر ۲۰ میلیمولار سدیم استات با ۶/۶ pH و شکل B مرحلهی دوم تخلیص با استفاده از بافر ۲۰ میلیمولار ایمیدازول با ۳/۷ pH را نشان میدهد.

۴-۱-۲- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان
به منظور تخلیص هموگلوبین A، از ۹ میلیلیتر خون تازه و سدیم سیترات برای جلوگیری از انعقاد خون استفاده شد. سرم از گلبولهای قرمز به وسیلهی سانتریفیوژ جدا گردد. در مرحله ی بعد پس از شستشوی گلبولهای قرمز با محلول کلریدسدیم (۹/۰ درصد)، ۵ حجم بافر فسفات ۲/۰ مولار با ۴/۷pH به گلبولهای قرمز اضافه و مخلوط به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۵۰۰۰ سانتریفیوژ شد. در ادامه به منظور هضم گلبولهای قرمز از آب دوبار تقطیر سرد استفاده شد و محلول حاصل مجددا سانتریفیوژ گردید. محلول رویی که حاوی هموگلوبین A بود، با استفاده از نمک ۲۰ درصد آمونیمسولفات رسوب داده شد و در نهایت برای جدا سازی ۲،۳ دیفسفوگلیسرات از هموگلوبین، محلول پروتئینی بر علیه بافر ۵۰ میلیمولار فسفات با ۴/۷pH به مدت۲۴ ساعت دیالیزشد و هموگلوبین خالص شده تا زمان مصرف در دمای ۲۰- درجهی سانتیگراد نگهداری شد.
به منظور تایید خلوص هموگلوبین از ژل SDS-PAGE (1درصد) به همراه مارکر وزن مولکولی پروتئین استفاده شد. همانطور که درشکل (۴-۱-۲) آمده است، در این روش هموگلوبین به صورت نیمه خالص تهیه شد.

شکل۴-۱-۲- نمایی از SDS-PAGE احیایی(۱۲درصد) فرآیند خالص سازی پروتئین هموگلوبین A انسانی. در این شکل M مارکر وزن م
ولکولی و F1 تا F3 نشان دهندهی نمونههای همو گلوبین نیمه خالص میباشد.

۴-۱-۳- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا در حضور مادهی احیا کننده
در این مطالعه جهت قندی کردن کازئینبتا به روش غیرآنزیمی از ۲ قند گلوکز و لاکتوز (با غلظت ۲۵۰ میلیمولار) و در حضور مادهی احیا کنندهی سدیم سیانوبروهیدارت (با غلظت ۲۱۲ میلیمولار) و دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد استفاده شد. مدت زمان انکوبه ۱۲۰ ساعت در شرایط تاریکی بود. پس از پایان مدت زمان ذکر شده به منظور حذف قند اضافی، محلول پروتئینی به مدت ۲۴ ساعت برعلیه آب مقطر و طی چند مرحله دیالیز شد ( Lee و همکاران ۱۹۷۹).

۴-۱-۳-۱- تائید قندی شدن کازئین بتا با استفاده از آزمونOPA
همانطور که در فصل سوم ذکر شد، OPA با گروههای آمین آزاد پروتئین واکنش میدهد و ترکیبی ایجاد میکند که در طولموج ۳۴۰ نانومتر دارای بیشینه جذب است. زمانی که مولکول قند به گروههای آمین آزاد پروتئین متصل میشود از اتصال OPA با این گروهها جلوگیری میکند در نتیجه در در طولموج ۳۴۰ نانومتر جذب کاهش مییابد. کاهش جذب معیاری برای ارزیابی میزان قندی شدن پروتئین میباشد (Khalili و همکاران ۲۰۱۲). شکل (۴-۱-۳) نتایج آزمون OPA فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا را نشان میدهد.

شکل۴-۱-۳- نتایج مطالعهی قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین کازئین بتا
با استفاده از آزمونOPA.
در این آزمایش غلظت پروتئین کازئینبتا ۵/۰ میلی گرم بر میلیلیتر بود که به محلول تازه تهیه شدهی OPA اضافه و به مدت ۲ دقیقه در دمای محیط انکوبه شد. سپس میزان جذب در طول موج ۳۴۰ نانومتر ثبت گردید. در شکل بالا -CNβ،Glc(β-CN) و Lac(β-CN) به ترتیب معرف کازئینبتای غیرقندی، کازئینبتای قندی شده با استفاده از قند گلوکز و کازئینبتای قندی شده با استفاده از قند لاکتوز میباشد. پس از انجام آزمون آماریt-test میزان معنیداری دادهها تعیین شد و P کوچکتر از ۰۰۰۱/۰ بود که با سه ستاره در شکل مشخص شد.

برای بیان میزان قندی شدن بر حسب درصد، میزان جذب خوانده شده برای پروتئین قندی بر میزان جذب خوانده شده برای پروتئین غیرقندی تقسیم، سپس عدد حاصل از یک کم و در ۱۰۰ ضرب شد.
۴-۱-۳-۲- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا با استفاده از آزمون